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标题: 关于ES细胞培养液的pH问题 [打印本页]

作者: carolshen 时间: 2010-12-27 14:35 标题: 关于ES细胞培养液的pH问题

在文献中，基本上没有提过这个问题，想请问下这里的朋友们，请问你们在培养ES细胞时，考虑了培养液的pH吗？

作者: hyde 时间: 2010-12-27 15:00

请教各种细胞培养基的颜色
http://www.stemcell8.cn/thread-25937-1-1.html

作者: 痞子的烟头 时间: 2010-12-27 15:43

以前我们实验室用的都是买的培养基DF12，其它的直接加上就可以用，没有测试PH，但是如果是自己的配，必须要测试！

作者: 上海过客 时间: 2010-12-27 16:14

新配出来的培养基是亮黄色。加进去过一段时间后变红色。再变成黄色就不能用了。

作者: carolshen 时间: 2010-12-27 16:24

呃，不好意思，谢谢大家的关注！2 h1 B' t& Z; c- v4 V
忘说明一下，我用的是条件培养基，就是制完conditioned medium之后，你们还有调节pH吗？

作者: heather_lu 时间: 2010-12-27 19:45

一般不调

作者: syl82 时间: 2011-2-15 19:56

本帖最后由细胞海洋于 2011-2-15 23:31 编辑

常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。
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小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏
胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。

在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 6 \4 s% w: s' i$ o- q9 Y
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。 " C* M+ T# r8 [) O
滋养细胞层（feeder cells layer）的制备   A+ ^, {. n' Y  m
把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。 ) {" n4 k0 U; c* m0 W2 ]6 h
把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。 ( t9 }4 _& Y6 r' L  @; o6 n0 F) e1 t! c
用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可） 5 l' ~9 n+ i3 g* x# y0 h+ d% k
一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。
小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏
在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。 ( }" \+ C- @" q; r
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 / }9 g, b6 g  I, \# b1 G
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。 + o( M& x3 J7 O1 u' Z3 m+ d' Q; Q
根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。
小鼠胚胎干细胞的传代 1 x& f+ {: J3 Z' O! n
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 7 X8 ]6 n$ ?2 u- Q
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 ) e, v. J, i) F* N% O& j! }
去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。 ' I  s: [8 l+ c% R
小鼠胚胎干细胞的冻存 6 D7 ^# A4 _8 g
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 % M9 e$ w  \( u# C  q
去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。 ( t4 I  O4 t) L2 V1 S9 L6 H
注意事项
丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。
ES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格 * G* R! t1 z- j! Z
ES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。 % N# v0 h7 |3 y/ g
为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。

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