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标题: 慢病毒转染的原理及过程（个人理解，求解惑） [打印本页]

作者: zerollx 时间: 2011-1-8 22:36 标题: 慢病毒转染的原理及过程（个人理解，求解惑）

最近看了一些有关慢病毒转染的文献，虽然知道其步骤，但对其具体原理及过程理解的还不是太透彻，看了文献之后有了一些心得，但同时也有一些疑问，希望大家能指点一次：
   慢病毒包装简要程序（本论坛上有）: O6 C3 \0 N. E1 q& u4 V5 \
第一天：. x* y3 W( D& ~8 \6 G9 g
1.用无抗生素DMEM+10%FBS铺板293FT细胞，2ml/孔。确保第二天细胞密度达到80%-90%融合度
第二天：
转染293FT细胞。  G# O( C6 l. |" C9 ?
  1. 500ul Opti-MEM稀释2ug pWPXLd-目的基因+1.5ug psPAX2+1.5ug pMD2.G
  2. 500ul Opti-MEM稀释15ul lipofectamine2000
  3. 5min后，将，溶液混合，室温静止30min ; T) S$ K$ Z& u2 G: Q  ?6 A$ Q
  4. 从6孔板中吸出1ml培养基，然后滴加入1ml质粒和脂质体混合物。9 Q6 \! k4 }6 `" O3 c
2. 6-10h后，移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液DMED+
10%FBS（从此刻开始算时间）。
第三天：; p" [2 Y0 D5 }) i* Q8 Q
3.转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到70%以上+ W2 |) d0 W* u8 z9 y
第四天：
4. 48h收获含病毒的上清，0.45um滤膜过滤，同时再往6孔板中加入2ml完全培养基+ }$ k4 t( ^! t& |# M8 E
4. 感染细胞：用一份病毒液+2份完全培养基感染目的细胞。
第五天：
5. 72h后再次收获病毒上清:将昨天感染的细胞离心去除上清，然后再次感染目的细胞。
6. 一般感染48h后，就能见到明显的荧光。: E  a. P* s3 Y5 [
   以下为个人理解部分：“ pWPXLd-目的基因”为能转录出慢病毒遗传物质（RNA），但不能翻译出慢病毒的外壳及蛋白成分的载体质粒，其同时连有目的基因和报告基因，psPAX2为能表达慢病毒外壳的质粒，其表达产物可通过粘附机制更易穿过细胞膜， pMD2.G为慢病毒的膜蛋白质粒，通过 lipofectamine2000进行三质粒共转到靶细胞基因组中，宿主基因组在表达时，随宿主基因转录出的“ pWPXLd-目的基因”RNA与psPAX2、pMD2.G基因翻译出的蛋白组装为慢病毒，在上述程序中提及的“第四天”收集病毒。在第五天再用该病毒感染靶细胞，病毒进入细胞后，其遗传物质RNA反转录出             “ pWPXLd-目的基因”，该基因再整合到靶细胞的基因组中，完成转染过程，因为“pWPXLd-目的基因”只能转录出病毒RNA和表达目的基因却不能表达出病毒的外壳和膜蛋白成分，因此其不能像普通的病毒一样在宿主细胞能反复增殖，故对宿主细胞是无害的并且高效的将目的基因转然到靶细胞基因组中。7 U( N- ^  j% \4 S# _
      不知道这样理解对不对，请大家点评一下。。。。。% P, y1 d' c( M6 e8 `4 T( ^

作者: 张也行 时间: 2011-1-9 09:22

谢谢分享

作者: shihuijunm 时间: 2011-1-9 17:21

O(∩_∩)O谢谢楼主分享太受益了，还想弱弱的问下，所用的包装细胞293FT能换成293T细胞吗？293FT和293T细胞最本质的区别在啥地方呀？

作者: fordhuhudadad 时间: 2011-1-9 22:24

刚刚开始学习病毒转染干细胞技术，谢谢前辈分享！

作者: zerollx 时间: 2011-1-9 22:28

回复 fordhuhudadad 的帖子
5 _, \$ v( O# K6 @9 E6 o+ B
呵呵，互相学习，我也刚开始接触，有机会多交流啊……

作者: fordhuhudadad 时间: 2011-1-10 22:15

Teacher zerollx ,小弟我还有一个问题，假如购买商品化的 LV（GFP+）套装，好像是2 X 10 6(大概200ul) 价格约 1000元，如果直接用来转染大鼠 MSC，从经济角度讲，可行么？非常感谢前辈回答我的问题。

作者: zerollx 时间: 2011-1-12 22:19

本帖最后由 zerollx 于 2011-1-12 22:27 编辑 3 d, V2 _4 t. N; R
3 v9 e: W6 V0 |8 B1 f
回复 shihuijunm 的帖子
4 F" m+ X7 c' ?8 S- I
能，我们实验室主要就用293T，不过查些资料上说293FT细胞能制造更高滴度的慢病毒，用于病毒包装究竟哪个更好些，还是需要自己摸索啊……

作者: zerollx 时间: 2011-1-12 22:32

回复 fordhuhudadad 的帖子/ |* w: T: U7 i( |
. F5 p) q3 M! r0 L- s
我们实验室都是用从其他地方带来的感受态大肠杆菌摇菌，买试剂盒来提的，哪个更经济些你得考虑你做的转染的次数多少，用什么试剂盒提，以及时间安排等各方面（提质粒很耗时的）综合考虑，再来考虑哪种更经济……

作者: shihuijunm 时间: 2011-1-13 13:16

回复 zerollx 的帖子3 U7 F" C) V/ a

谢谢啦 O(∩_∩)O~

作者: fordhuhudadad 时间: 2011-1-13 21:12

回复 zerollx 的帖子4 p7 ]* W8 c& @8 T {

多谢前辈了！我们学医出身的做分子生物实验基础很差，一切要从头开始。今后再继续请教前辈！

作者: zerollx 时间: 2011-1-13 21:57

回复 fordhuhudadad 的帖子7 L% ]" F! f, P- x2 o
( j3 S1 q% o. @5 n! T9 u# A
互相交流学习，我也刚开始学……

作者: 张也行 时间: 2011-3-6 21:41

zerollx 发表于 2011-1-8 22:36 ) y# W7 P3 u' j" p5 ?' S) E& R8 i
最近看了一些有关慢病毒转染的文献，虽然知道其步骤，但对其具体原理及过程理解的还不是太透彻，看了文献之 ...

, a% H# Z v2 }% P. ?% l
我有两个问题：
1. 关于计时的问题：是Lipo 2000转染后6小时换液时开始计时，还是转染就开始计时？/ `$ C9 A7 p. ?5 T& X( u8 U
2. 你说的第5步我不是很明白，病毒感染一天后，离心后再次感染是怎么回事？你是说消化后重新铺板，贴壁后再感染一次吗？

作者: greenjing 时间: 2011-5-4 16:22

谢谢各位前辈了，我做的是慢病毒感染悬浮细胞，感染了2个细胞，有个细胞感染的效率在40-50%，另一个只有20%，如何提高其感染效率，谢谢

作者: 细胞海洋 时间: 2011-5-4 20:20

回复 greenjing 的帖子
' o1 j4 l1 q. }: g
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作者: wynmaggie 时间: 2011-5-17 10:05

，对理解有很大帮助！但是病毒进入细胞应该叫做转导吧！

作者: YLL824WAN 时间: 2011-6-2 19:16

谢谢啊

作者: lawk00 时间: 2012-7-13 13:56

回复 zerollx 的帖子* t$ L# `6 E# g9 ~6 k' a( i% N% ~
) U6 h% X, J k
不过我看文献好像说 293T感染更好一点。

作者: zerollx 时间: 2012-7-13 16:14

回复 lawk00 的帖子
1 G5 H( h( \" g" x' W1 | F
个人习惯吧，用于病毒包装的细胞有很多，293T，293FT，phoenix，plate E，与你所用的病毒载体系统也是有关联的，我们用的是慢病毒载体，用一直用的也是293T，效果挺好，其它的没尝试过！

作者: lawk00 时间: 2012-7-13 19:02

回复 zerollx 的帖子$ W# B+ \6 v0 u* K6 [( f
- F- W, M# g4 V6 r/ K) R2 I
我也一直用293T!

作者: 第一心音 时间: 2012-10-12 20:44

我们也用的293T，其他种类的细胞我也用过，不好，建议不要用，还有，你的思路很清晰，过程正确

作者: 芦苇浅 时间: 2014-1-11 20:09

回复 shihuijunm 的帖子

The 293FT Cell Line, a derivative of the 293F Cell Line, stably and constitutively expresses the SV40 large T antigen from pCMVSPORT6TAg.neo and must be maintained in medium containing
Geneticin. So it's different from the 293 T cell line.
Best regards!

作者: 芦苇浅 时间: 2014-1-11 20:16

回复 greenjing 的帖子

There are so many factors influncing your transduction efficiency:1. MOI too low; 2. Too much antibiotic used for selection; 3. Cells harvested too soon after transduction; 4. Gene of interest is toxic to cells; 5. Non-dividing cell type used etc.

作者: yiyi8909 时间: 2014-5-14 19:57

回复 zerollx 的帖子. O: w2 h# _' I; ]# o$ b

好像看有的说F的意思就是fast，生长速度比293T快，它们两个都是整合了SV40大T抗原。具体的也不是很清楚。
The 293FT Cell Line is derived from the 293F Cell Line and stably6 M" z4 S0 {7 |+ Z7 |6 `
expresses the SV40 large T antigen from the pCMVSPORT6TAg.neo plasmid.; _4 Q! K, s# }' ?
Expression of the SV40 large T antigen is controlled by the human cytomegalovirus9 o& Q! s( L- L. Y
(CMV) promoter and is high-level and constitutive. Studies have demonstrated maximal virus production in human 293 cells expressing SV40 large T antigen (Naldini et al., 1996), making the 293FT Cell Line a particularly suitable host for generating lentiviral constructs using the ViraPower Lentiviral Expression System available from Invitrogen./ U! M2 \; C5 h. D) M) e
The 293 Cell Line is a permanent line established from primary embryonal human
kidney transformed with sheared human adenovirus type 5 DNA (Graham et al.,/ T1 e& A( t" A
1977; Harrison et al., 1977). The E1A adenovirus gene is expressed in these cells% Z) d* Q# [% h, M4 o! ~4 W; f( `
and participates in transactivation of some viral promoters, allowing these cells to$ N# Y8 M4 Z- B2 _# Z; X: s3 Y
produce very high levels of protein.
The 293-F Cell Line available from Invitrogen (Catalog no. 11625) is a fastgrowing8 S9 w- p- y0 h( E+ n- Y2 ]; e
variant of the 293 cell line, and was originally obtained from Robert Horlick at Pharmacopeia.
这个以供参考！

作者: thinktank 时间: 2014-6-16 12:46

不错。

作者: 小兔子lp 时间: 2014-8-14 13:57

如果不包装病毒，直接用脂质体2000转染目的细胞，比如MEF，结果会怎样呢？目的基本是不是也能转染到MEF中去？

作者: 细胞海洋 时间: 2014-8-15 08:29

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作者: qinrui 时间: 2017-5-31 12:35

你好

作者: 温宗壮 时间: 2017-8-6 19:21

实用，多谢

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