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标题: 请教一个连接反应的问题 [打印本页]

作者: mckf111 时间: 2011-1-15 12:32 标题: 请教一个连接反应的问题

最近在做双酶切总是长不出克隆设了各种对照焦点最终落到连接和感受态两步上0 r1 F) p# Z/ _+ ~/ Z
感受态问题已解决
关于连接我突发奇想在10ul的连接体系中取了5ul去跑胶按照预期连接成功应有1条不成功则2条我估计两样都有那应该是3条
可最终结果是——0条
哪位大牛能给我解释下
P.S.有师兄说可能浓度太低条带看不到但我觉得不可能因为我酶切-跑胶-回收之后将质粒和目的基因各为5ul再次跑胶估测浓度两者浓度相当而且都很亮那么我做连接时取了8ul的目的基因和1ul的质粒那么跑胶时应该分别是4ul和0.5ul 按照前述经验不可能浓度淡到看不出条带大家赞同不？？？

作者: chochochocho 时间: 2011-1-15 13:12

本帖最后由 chochochocho 于 2011-1-15 13:13 编辑
5 R+ D" T/ Y: w3 u9 b4 v
我被你的问题弄糊涂了，你说你连接体系10ul，其中目的片段8ul，载体1ul。余下的1ul是连接酶么？不用加Buffer的么？？你用的是哪一种ligation kit啊？

作者: mckf111 时间: 2011-1-15 14:07

回复 chochochocho 的帖子3 g/ S, Q4 O* k6 J

我说了个大概准确的是载体1ul；目的片段7.8ul；10×BUFFER 1ul；酶0.2ul，总共10ul。! f2 }! |! x$ c- S
可能您会怀疑酶怎么这么少，因为我用的是fermentas的T4连接酶（和另一个帖子里仁兄说的一样），其为5u/ul，说明书上说20ul的体系只要用1个u，我的10ul体系加了0.2ul（相当于1u）应该还超量了。。。因为没有0.1ul的枪，没办法。。。

作者: chochochocho 时间: 2011-1-15 15:51

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3 B" U6 n1 f6 L9 w% \
你的目的片段用什么溶解的？如果是TE的话，换成MQ。DNA浓度不够的情况下，可以先做乙醇沉淀再连接，不要用大体积的DNA溶解液做链接体系，离子杂质很多，影响连接效果。frementas没用过。我通常取1ul（50-100ng）电泳，一般不会只有一条带，还会有一些小size的杂带，但目的片段与载体连接后的产物带最亮。想不通啊，你的DNA都哪儿去了呢？

作者: mckf111 时间: 2011-1-15 16:05

本帖最后由 mckf111 于 2011-1-15 16:07 编辑 ) E3 L# Z9 B; ^. v( S8 G, k2 `& B
9 P+ S1 {( P% ], u; [) n
回复 chochochocho 的帖子: E, i/ Y9 }. p8 O1 U9 a
9 Z9 P& O/ ^8 y& x& \ k
谢谢目的片段用胶回收KIT 最后应该是Eluent溶解的应该是Tris 那MQ是什么？4 @5 ~: g( D- u& s
但不管咋样我加进去的DNA怎么都看不到呢我很疑惑。。。

作者: chochochocho 时间: 2011-1-15 16:22

本帖最后由 chochochocho 于 2011-1-15 16:23 编辑 ) C! k" M$ n! B, Z
% u* ~ M; K8 Q
Milli-Q water就是蒸馏水再0.22um过滤的那种，我不知道是叫灭菌水？还是去离子水？还是什么的。离子Buffer不适合大体积用来做连接体系的，达到总体积1/3就最大限度了。哦，你胶回收之后做了电泳检测了么？估计大概浓度多少？7.8ul是多少ng？

作者: mckf111 时间: 2011-1-15 17:15

回复 chochochocho 的帖子' H3 A: P# K" n0 P+ w
, D5 D. c8 C+ w
原来是超纯水啊～～
做了电泳啊咱这分光计坏了没具体去测但用5ul跑出来质粒和目的基因亮度相当而且有一般内参那种亮度我想浓度应该不会差的' A0 g0 `+ E0 R
“离子Buffer不适合大体积用来做连接体系的，达到总体积1/3就最大限度了。”这句话我没太看明白求详

作者: chochochocho 时间: 2011-1-15 17:24

哦，超纯水啊。如果你用离子溶液溶解的DNA，在做连接的时候你所加的DNA溶液要小于连接体系的1/3。( K- }: E' W1 S1 N
比如：连接体系9ul，那么DNA<3ul；要是用超纯水溶解的，就没关系了，但是由于缺乏离子环境不能长时间保存DNA。

作者: mckf111 时间: 2011-1-15 18:04

回复 chochochocho 的帖子7 J& u: h2 K J2 Y; F+ x

那会不会导致因目的片段太少连接产物过少啊不说一般都要是质粒的3-10倍么。。。
另外剩下来的体积是用ddH2O补齐么？看师兄们做的时候都不加水的把目的片段代替水猛加。。。

作者: chochochocho 时间: 2011-1-15 19:09

你们都是猛人

结果可以么？不会变少的，你没明白我的意思，DNA量没有变，是被浓缩了。比如：500ng质量不变，体积从7.8ul到2ul。我从没用过ddH2O做过分子实验，都是用的MQ，不过我想都一样吧。

作者: mckf111 时间: 2011-1-15 20:20

回复 chochochocho 的帖子

结果是8个克隆5个阳性或者更高。。。, _3 H* z* U; U- K) Y' h( V
那如何浓缩DNA呢洗脱的时候说明书上就是要25-30ul的洗脱液洗脱那如何对洗脱下来的DNA浓缩？
MQ我们轻易不给用穷。。。

作者: ligangcw 时间: 2011-1-15 20:56

连接了，跑电泳没了！看看两个片段的大小，是不是链接后太大没跑出来？做几遍了？若一遍的话，再试试，看看实验重复性！转了没长出来，感受态没问题，看来问题还在质粒上，感受态(可以试试碧云天的超级感受态制备试剂高效方便）

作者: mckf111 时间: 2011-1-16 10:14

回复 ligangcw 的帖子

不会太大跑不出来我目的片段很小就200多bp0 [3 y$ m# [7 a9 m1 f
重复了三次还是这样我等下传张图上来

作者: mckf111 时间: 2011-1-16 10:24

第二泳道为MARKER 最下面是100bp 最上面是1500bp 最亮的是500bp
第三泳道是质粒+288bp目的片段
第四泳道是质粒+570bp目的片段7 y Y) C* a! C5 {+ `3 @
质粒为pIRES2-EGFP，大小为5.3kb，选择的双酶切位点分别是上游BglⅡ，下游EcoRⅠ。; V% q! y6 e M, z
这是我昨天晚上做的连接，体系是：1.5ul 质粒+11ul 目的片段+1ul T4 ligase+1.5ul 10×BUFFER=15ul 体系，16度过夜，早上起来取了4ul跑电泳，就出来上述图，杯具。。。
P.S. 因为昨天担心是不是酶和BUFFER有问题，于是用了师兄的来做，TAKARA的ligase和10×BUFFER，可结果。。。

图片附件: 2011116_94712.jpg (2011-1-16 10:15, 82.37 KB) / 下载次数 121
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=MjA0Nzd8NmUxYjVkYmZ8MTc4NzY3NTQxNnww

作者: scl6682005 时间: 2011-1-16 11:16

将质粒和目的基因各为5ul再次跑胶估测浓度两者浓度相当而且都很亮那么我做连接时取了8ul的目的基因和1ul的质粒那么跑胶时应该分别是4ul和0.5ul ; z4 o2 }. T8 C0 n7 {, V
( f6 @: b% U0 w+ P ^
不建议连接后直接跑胶,还是要老老实实转化扩增后再检测.连接效率可能不高,所以连接后应该有三种片断:目的片段,载体，载体+目的片段。你只加了1ul质粒，所以载体，载体+目的片段可能都看不到。如果目的片段连接时串联的话，再稀释一下，琼脂糖的分辨率又不高，就都看不到了。* e: E6 M4 A) w3 e5 h6 p! E& W
以上分析是基于你的电泳没有问题的情况下。

作者: chochochocho 时间: 2011-1-16 11:35

本帖最后由 chochochocho 于 2011-1-16 11:59 编辑 - B$ y: X' {& U5 S) J2 Q v% g9 ]

回复 mckf111 的帖子

1，乙醇沉淀步骤：我刚发了新鞋，你看看吧，希望对你有帮助。
http://www.stemcell8.cn/forum.ph ... mp;extra=#pid269345
2，MQ和dDW不是问题，不用在意。
3，连接后由于杂带多，亮度确实会弱很多，看你的电泳结果还好啊，说明连接没问题。最上边由于没有marker,估计不出大小，但3,4泳道大小有差别，貌似连接了。建议转化，扩增，检测。杂片段在转化后自有抗性筛选& E' C7 ^/ _: n
4，你个人认为这和你之前电泳结果相似么？想看看你发帖子那次电泳图。

作者: chochochocho 时间: 2011-1-16 11:56

本帖最后由 chochochocho 于 2011-1-16 12:10 编辑 # M! G. L3 i! f* Z# n

回复 scl6682005 的帖子

个人认为跑胶查看是很有效的方法，可省时省力省money，值得尝试，目前111所要积累的就是经验，如何判断连接结果。我想你没有检测过，其实结果并不只有3种片段。虽然1ul上样，可能是100ng，500ng，1ug

做实验‘老老实实’，那是technician；做科研，不能太‘老实’，有想法就可以尝试啊。1 o+ U: I# C- G* x! X

作者: 绿雪 时间: 2011-1-16 19:13

如果确实想拿连接产物鉴定是否连接上的话，可以那1ul的连接产物做模板跑个PCR，引物用载体通用引物。如果有连上的可以看到比插入片段稍大的条带。个人不建议用连接产物跑电泳来检测。

作者: 老虎菜998 时间: 2011-1-17 10:46

连接反应不是问题的关键，关键还是DNA哪去了？如果电泳时没发现不进胶的情况，那就是DNA降解了。建议从这方面寻找原因。降解的可能有多种，最主要的有：连接酶及体系中有核酸酶污染，其次是反应管或回收导致的核酸酶污染。

作者: ligangcw 时间: 2011-1-17 22:11

还有你的电泳缓冲液似乎用的用的有点久了，想重复次数多些可用MQ水配制

作者: hughliang 时间: 2011-1-19 14:49

记得分子克隆上说，如果用EB，50ngDNA可以显影。* t/ H' `8 ^/ z; x

如果连接效率不够高，连接后的片段不到50ng，看不见很正常，所以没有必要用跑胶来检查连接效果。 c, ~* Z$ ?+ c# A: I2 I

可是看不见你的载体和插入片段就有点奇怪了。

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