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标题: 请教一个连接反应的问题 [打印本页]
作者: mckf111    时间: 2011-1-15 12:32     标题: 请教一个连接反应的问题

最近在做双酶切 总是长不出克隆 设了各种对照 焦点最终落到连接和感受态两步上9 j" A- Z+ q; H  z
感受态问题已解决
7 C$ _. X$ V  o3 r! Q: X0 J关于连接 我突发奇想 在10ul的连接体系中取了5ul去跑胶 按照预期 连接成功应有1条 不成功则2条 我估计两样都有 那应该是3条  j( U1 b9 L% `5 ?4 \
可最终结果是——0条
0 I8 ~# y1 R( f7 a7 T% }8 A哪位大牛能给我解释下
$ U9 ^5 x1 K9 d( ZP.S.有师兄说 可能浓度太低 条带看不到 但我觉得不可能 因为我酶切-跑胶-回收之后 将质粒和目的基因各为5ul再次跑胶估测浓度 两者浓度相当 而且都很亮 那么 我做连接时取了8ul的目的基因和1ul的质粒 那么跑胶时应该分别是4ul和0.5ul 按照前述经验 不可能浓度淡到看不出条带 大家赞同不？？？
作者: chochochocho    时间: 2011-1-15 13:12

本帖最后由 chochochocho 于 2011-1-15 13:13 编辑 % a5 O& @- u* L1 `

9 Y6 E, Z; i3 |  ~1 Z+ ]' c3 v8 q我被你的问题弄糊涂了，你说你连接体系10ul，其中目的片段8ul，载体1ul。余下的1ul是连接酶么？不用加Buffer的么？？你用的是哪一种ligation kit啊？
作者: mckf111    时间: 2011-1-15 14:07

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: K3 K* g+ N9 A. Q, r9 }' k! E% C* W
2 b6 }$ [* y) E我说了个大概 准确的是载体1ul；目的片段7.8ul；10×BUFFER 1ul；酶0.2ul，总共10ul。
! a  Q$ Y  ]4 b# O& i  U可能您会怀疑酶怎么这么少，因为我用的是fermentas的T4连接酶（和另一个帖子里仁兄说的一样），其为5u/ul，说明书上说20ul的体系只要用1个u，我的10ul体系加了0.2ul（相当于1u）应该还超量了。。。因为没有0.1ul的枪，没办法。。。
作者: chochochocho    时间: 2011-1-15 15:51

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- ?1 q; k. v$ a1 ]& C
2 _+ d# t8 a1 {' N你的目的片段用什么溶解的？如果是TE的话，换成MQ。DNA浓度不够的情况下，可以先做乙醇沉淀再连接，不要用大体积的DNA溶解液做链接体系，离子杂质很多，影响连接效果。frementas没用过。我通常取1ul（50-100ng）电泳，一般不会只有一条带，还会有一些小size的杂带，但目的片段与载体连接后的产物带最亮。想不通啊，你的DNA都哪儿去了呢？
作者: mckf111    时间: 2011-1-15 16:05

本帖最后由 mckf111 于 2011-1-15 16:07 编辑
8 k. h2 w3 B0 C6 I6 c+ X! `- f, N/ \" ]$ c: E, w6 v3 ?2 }+ t
回复 chochochocho 的帖子) v: ?4 k+ a5 L  k
) Y9 ?" m9 z( l2 a0 a% h* S
谢谢 目的片段用胶回收KIT 最后应该是Eluent溶解的 应该是Tris 那MQ是什么？
- z% Z3 D) D2 X) H3 |( B但不管咋样 我加进去的DNA怎么都看不到呢 我很疑惑。。。
作者: chochochocho    时间: 2011-1-15 16:22

本帖最后由 chochochocho 于 2011-1-15 16:23 编辑 0 T' ^: W) O/ }1 e6 E9 \+ v

, J) u5 I6 e5 eMilli-Q water就是蒸馏水再0.22um过滤的那种，我不知道是叫灭菌水？还是去离子水？还是什么的。离子Buffer不适合大体积用来做连接体系的，达到总体积1/3就最大限度了。哦，你胶回收之后做了电泳检测了么？估计大概浓度多少？7.8ul是多少ng？
作者: mckf111    时间: 2011-1-15 17:15

回复 chochochocho 的帖子
" I/ R/ y% L. r
( z4 c8 b8 z) R" N  `( p& I* ^原来是超纯水啊～～" O  e5 F' O. G5 x, a: i# _
做了电泳啊 咱这分光计坏了 没具体去测 但用5ul跑出来 质粒和目的基因亮度相当 而且有一般内参那种亮度 我想浓度应该不会差的3 g$ d. z+ s* V, m6 E: b
“离子Buffer不适合大体积用来做连接体系的，达到总体积1/3就最大限度了。”这句话我没太看明白 求详
作者: chochochocho    时间: 2011-1-15 17:24

哦，超纯水啊。如果你用离子溶液溶解的DNA，在做连接的时候你所加的DNA溶液要小于连接体系的1/3。
4 i- p6 ]: ?8 E( e) }/ b比如：连接体系9ul，那么DNA<3ul； 要是用超纯水溶解的，就没关系了，但是由于缺乏离子环境不能长时间保存DNA。
作者: mckf111    时间: 2011-1-15 18:04

回复 chochochocho 的帖子6 ]: ?2 J# S2 M8 ]& i* K% o! q. `

8 \! ?- `* ]% }% o4 I3 P! {那会不会导致因目的片段太少 连接产物过少啊 不说一般都要是质粒的3-10倍么。。。# C3 H( C8 d! b9 r8 \5 V
另外 剩下来的体积是用ddH2O补齐么？看师兄们做的时候 都不加水的 把目的片段代替水猛加。。。
作者: chochochocho    时间: 2011-1-15 19:09

你们都是猛人结果可以么？不会变少的，你没明白我的意思，DNA量没有变，是被浓缩了。比如：500ng质量不变，体积从7.8ul到2ul。我从没用过ddH2O做过分子实验，都是用的MQ，不过我想都一样吧。
作者: mckf111    时间: 2011-1-15 20:20

回复 chochochocho 的帖子
, t8 P( Q  A3 T, ?( z8 E$ L9 e
8 N0 a& C1 b) \/ E2 L; D2 k9 o结果是8个克隆5个阳性或者更高。。。
" C/ p6 F0 R/ C/ O5 Q  Y那如何浓缩DNA呢 洗脱的时候说明书上就是要25-30ul的洗脱液洗脱 那如何对洗脱下来的DNA浓缩？
6 @! ^4 y' J6 V, B5 dMQ我们轻易不给用 穷。。。
作者: ligangcw    时间: 2011-1-15 20:56

连接了，跑电泳没了！看看两个片段的大小，是不是链接后太大没跑出来？做几遍了？若一遍的话，再试试，看看实验重复性！转了没长出来，感受态没问题，看来问题还在质粒上，感受态(可以试试碧云天的超级感受态制备试剂高效方便）
作者: mckf111    时间: 2011-1-16 10:14

回复 ligangcw 的帖子4 d+ O4 ^  w7 v6 v

- P8 q8 _; U2 ?7 r/ }9 P- ~2 A不会太大跑不出来 我目的片段很小 就200多bp
6 r; @& B0 `5 S1 z. y重复了三次 还是这样 我等下传张图上来
作者: mckf111    时间: 2011-1-16 10:24

2011116_94712.jpg - S7 Z8 G3 ?+ Q4 k3 a4 W4 G$ ]1 R
第二泳道为MARKER 最下面是100bp 最上面是1500bp 最亮的是500bp
, `' b/ L2 X# v第三泳道是质粒+288bp目的片段
# @3 g( @% w3 z7 I9 w( s% o9 I% ~第四泳道是质粒+570bp目的片段
6 _+ j" }6 l. X; W( D$ ^' }质粒为pIRES2-EGFP，大小为5.3kb，选择的双酶切位点分别是上游BglⅡ，下游EcoRⅠ。, v- F" _. P- z0 J/ K: v! U
这是我昨天晚上做的连接，体系是：1.5ul 质粒+11ul 目的片段+1ul T4 ligase+1.5ul 10×BUFFER=15ul 体系，16度过夜，早上起来取了4ul跑电泳，就出来上述图，杯具。。。
. c8 i2 }: v5 V3 ?( F) ]- w% C# cP.S. 因为昨天担心是不是酶和BUFFER有问题，于是用了师兄的来做，TAKARA的ligase和10×BUFFER，可结果。。。

图片附件: 2011116_94712.jpg (2011-1-16 10:15, 82.37 KB) / 下载次数 122
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=MjA0Nzd8NjBkNzIzYWR8MTc5MzE4NDExNXww

作者: scl6682005    时间: 2011-1-16 11:16

将质粒和目的基因各为5ul再次跑胶估测浓度 两者浓度相当 而且都很亮 那么 我做连接时取了8ul的目的基因和1ul的质粒 那么跑胶时应该分别是4ul和0.5ul
$ M0 e; X) }' _7 w" Z" P* v4 \5 V5 d0 m: D0 H- P& M+ ^( T: v
不建议连接后直接跑胶,还是要老老实实转化扩增后再检测.连接效率可能不高,所以连接后应该有三种片断:目的片段,载体，载体+目的片段。你只加了1ul质粒，所以载体，载体+目的片段可能都看不到。如果目的片段连接时串联的话，再稀释一下，琼脂糖的分辨率又不高，就都看不到了。/ K8 b* z) }: }, e1 G8 m( q
以上分析是基于你的电泳没有问题的情况下。
作者: chochochocho    时间: 2011-1-16 11:35

本帖最后由 chochochocho 于 2011-1-16 11:59 编辑
  u3 \& z* h2 L: A! b
' [) n* ]7 ?7 J  e  w0 P回复 mckf111 的帖子
$ ?8 i# \- P$ ^2 m" A" N0 C
: |6 P0 ^& F9 W- W7 K  o1，乙醇沉淀步骤：我刚发了新鞋，你看看吧，希望对你有帮助。( e- ~/ h, a& ]& W7 A7 I7 G
http://www.stemcell8.cn/forum.ph ... mp;extra=#pid2693457 N* V6 g: y2 `7 y& `, ?; J# }
2，MQ和dDW不是问题，不用在意。
2 C' {. [' S! E+ E1 g5 j( `" Y6 \3，连接后由于杂带多，亮度确实会弱很多，看你的电泳结果还好啊，说明连接没问题。最上边由于没有marker,估计不出大小，但3,4泳道大小有差别，貌似连接了。建议转化，扩增，检测。杂片段在转化后自有抗性筛选
2 c1 Z; E$ j- C  b( x' N4，你个人认为这和你之前电泳结果相似么？想看看你发帖子那次电泳图。! N0 H/ d' C2 h# S
作者: chochochocho    时间: 2011-1-16 11:56

本帖最后由 chochochocho 于 2011-1-16 12:10 编辑
/ b+ s- ]* ^/ q1 `! m( }
7 H7 p0 ]0 D, b3 c; n. {- S1 i回复 scl6682005 的帖子$ u- Y  `0 T+ j* S, i- r$ [
% w5 w" M* K1 k
个人认为跑胶查看是很有效的方法，可省时省力省money，值得尝试，目前111所要积累的就是经验，如何判断连接结果。我想你没有检测过，其实结果并不只有3种片段。虽然1ul上样，可能是100ng，500ng，1ug 做实验‘老老实实’，那是technician；做科研，不能太‘老实’，有想法就可以尝试啊。
1 P6 x7 F2 P) T, J2 i
作者: 绿雪    时间: 2011-1-16 19:13

如果确实想拿连接产物鉴定是否连接上的话，可以那1ul的连接产物做模板跑个PCR，引物用载体通用引物。如果有连上的可以看到比插入片段稍大的条带。个人不建议用连接产物跑电泳来检测。
作者: 老虎菜998    时间: 2011-1-17 10:46

连接反应不是问题的关键，关键还是DNA哪去了？如果电泳时没发现不进胶的情况，那就是DNA降解了。建议从这方面寻找原因。降解的可能有多种，最主要的有：连接酶及体系中有核酸酶污染，其次是反应管或回收导致的核酸酶污染。
作者: ligangcw    时间: 2011-1-17 22:11

还有你的电泳缓冲液似乎用的用的有点久了，想重复次数多些可用MQ水配制
作者: hughliang    时间: 2011-1-19 14:49

记得分子克隆上说，如果用EB，50ngDNA可以显影。
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如果连接效率不够高，连接后的片段不到50ng，看不见很正常，所以没有必要用跑胶来检查连接效果。
5 @  G( ~7 G* J& z, L0 R2 Q
+ F! Q6 k3 o+ ~& N" w* J9 ^. C! R可是看不见你的载体和插入片段就有点奇怪了。



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