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标题: 利用小分子复合物诱导出ipsc原文及简析 [打印本页]

作者: zerollx 时间: 2011-2-12 20:53 标题: 利用小分子复合物诱导出ipsc原文及简析

体细胞的重编程可通过 Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc or Oct4/Sox2/Nanog/LIN28的病毒转染法而实现，最近又有报道仅用 Oct4/Klf4便将神经祖细胞重编程为ipsc，这是因为NPC可内源性表达OCT4.这篇研究中，我们用小分子BIX-01294 and BayK8644联合病毒转染Oct4/Klf4入小鼠的成纤维细胞，该细胞没有相关的内源性基因的表达，也得到了ipsc，说明通phenotypic screen得到的小分子能够替代病毒转染用的一些因子如OCT4，并且提高了重编程的效率（相比于去掉c-Myc的Oct4/Sox2/Klf4方法）2 b/ |" p, x' ]( k( z: f4 U2 N, l$ s
BIX 与Bayk 的作用机制：
1、BIX: 在NPC的诱导试验中，进一步的研究表明在此过程中，G9a histone甲基转移酶受到抑制(G9a HMTase)后，重编程的水平大大提高了，BIX便是G9a HMTase的一种抑制剂，( ]! l. i( E1 I+ V4 ?5 W
' u3 ]. Y5 I/ q
2、Bayk 是一种L-channel calciumagonist，它并不引起表观修饰，而是在信号转导方面起重要作用。L-type calcium channels 在细胞内的不同组织内介导一系列的过程，如blood pressure regulation, smooth-muscle contractility, insulin secretion, cardiac development, 其通过CREB作用使Ca2+释放，改变cAMP水平，此外，Ca2+在mESCDE 增殖过程中也有着重要作用。

BIX-01294 、BayK8644、Oct4和Klf4共同作用与小鼠的成纤维细胞的结果：
仅用OCT4和Klf4得到的ipsc形态不明显，ALP也很弱，而且无法扩增，0 j8 X5 c( p& \' F  ?% v3 |
用OCT4和Klf4加上BIX处理，在此之后的14-21天内，得到强表达ALP的克隆，而且Nanog, Oct4, and SSEA-1也呈阳性，但其诱导率明显低于 Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc 4因子诱导和OCT4、Klf4、BIX联合诱导 NPC的过程，这个结果表明表观修饰在重编程的过程中也起着重要的作用。
在OCT4和Klf4加上BIX的基础上，又添加了其它的小分子，结果又发现了5-azacytidine、RG108和BayK，前二者与BIX相似，是 DNA methyltransferase的抑制剂，后者是一种L-channel calciumagonist，它并不引起表观修饰，而是在信号转导方面起重要作用，而且在无BIX处理的过程中，单纯依靠OCT4、Klf4和BayK是无法引起重编程的。

进一步确定其多能性
用含Oct4-GFP reporter的MEF为材料，结果与上述相似，即仅用OCT4和Klf4、用OCT4和Klf4加上BIX处理时得到很少的克隆。用OCT4和Klf4加上BIX、BayK处理时得到较多的克隆，单纯依靠OCT4、Klf4和BayK无克隆形成。6 T7 V! t% Q: D+ s; ?
检测其多能性：3 J- V' X) C  h% H7 A
1、DAPI、APK染色和 RT-PCR显示这些GFP+OK2B iPSCs 表达了典型的多能性标记： ALP, Nanog, Sox2, Oct4,SSEA1, c-Myc, eRas, Esg1, Ecat1, and Fgf4.
2、Bisulphite genomic分析Nanog 启动子的去甲基化程度与ESC相当，与MEF想去甚远。
3、Transcriptome分析analysis showed that expression proﬁle of OK2B iPSCs is greatly similar to the one of mESCs with a Pearson correlation value of 0.96, while signiﬁcantly different to MEFs’ proﬁle with a Pearson correlation value of 0.84 as exempliﬁed in the clustering analysis% I1 L! x" z9 J) I( R) h7 O! |
4、分化潜能:+ ^# R( P, u/ w0 |' N
   （1）类胚体实验：对得到的EB用DAPI染色，显示三胚层均有分化：内胚层 (Albumin and Pdx1),中胚层 /心肌(CT3), 外胚层/neurons (bIII-tubulin, Tuj1).
   （2）2N囊胚注射：将ipsc注入8细胞期的囊胚中，再移植入同期的小鼠子宫中得到嵌合体小鼠，将得到的一个雄性嵌合体小鼠与野生型雌鼠杂交，得到的后代小鼠中得到了有LacZ+和Oct4-GFP+细胞的小鼠，说明该ipsc能整合到生殖系产生精子，证明了其全能性。

作者: stonelee2050 时间: 2011-2-12 21:02

可不可以具体的介绍一下你们的方法呢？具体步骤哦。

作者: flydayzhu 时间: 2011-2-12 22:10

被忽悠了，还以为是完全chemical的。。。。。

作者: zerollx 时间: 2011-2-12 22:12

回复 flydayzhu 的帖子
( g8 C: ~( h9 f
呵呵，那篇文章我也想要啊……

作者: 钻石星辰 时间: 2011-2-12 22:14

你介绍的是08年Cell stem Cell上的文献。 q. K$ A* ]& e6 O/ J! G

目前iPS领域研究热点之一就是利用small molecules替代transcription factor，或者尽可能减少transcription factor的种类，特别是c-myc和klf4。( T" X/ R8 o- W: p) L: |- i
7 g) q1 p% R7 G% B/ X
现在最新的文献已报道联合small molecules compounds可以仅仅导入单个转录因子Oct4就可诱导出iPS，不过效率很低。

作者: zerollx 时间: 2011-2-13 08:30

回复 stonelee2050 的帖子

这个文献里面有，仔细看看就知道了

作者: flydayzhu 时间: 2011-2-13 12:20

回复 zerollx 的帖子+ s# F% N8 r1 y: j2 T) w
# c8 B7 R( `/ f
恩，谢谢~

作者: scienese 时间: 2011-2-13 13:54

老兄的题目有点歧义啊！

作者: zerollx 时间: 2011-2-13 14:45

嗯，没注意与最新的那篇文章区别开来，下次一定注意！！！！

作者: fantafiction 时间: 2011-3-3 09:25

请问BIX 与Bayk如何筛选找到的?

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