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标题: 关于Splinkerette PCR的一些疑惑 [打印本页]
作者: 钻石星辰    时间: 2011-2-14 10:55     标题: 关于Splinkerette PCR的一些疑惑

大家好，最近要开始做一些splinkerette PCR的实验。目的是检测transposon在genome中插入位点的位置和数量。
: l! d. V" i, c7 D* w, |* F% _( U0 q7 O5 v1 s+ g
我查到一篇名为《Splinkerette PCR for Mapping Transposable Elements in Drosophila》,它的大致原理如图：
" m/ H) y6 I5 g, @" w3 P7 ?% Q: U+ x0 v  c# Y2 M
1. 全基因组DNA提取
  |8 \% M3 E8 M0 [% c. ~2. 限制性内切酶酶切全基因组DNA，获得"GATC"粘性末端1 g. q; M" P! W
3. 酶切好的DNA片段与splinkerette adaptor连接. e1 W  m2 y- Z
4. 1st-Round PCR3 E. [4 P/ s0 s  l0 `; R
5. 2nd-Round PCR/ v! c" P: w: h/ z, p
6. Sequencing9 q. \2 w! e. f% ~' `& i' S

% c- n5 X  P; q7 }7 M现在有一个问题比较困扰我：2nd-Round PCR的产物是直接拿去测序，还是先在胶上跑一下切胶回收再拿去测序？& _( I6 U# R) B8 W* H
因为如果transposon的插入位点有2个以上的话，2nd-Round PCR的产物将是一个混合产物。这样不好测序吧？
. S" p' X$ Q; B5 T+ F3 }- C: D' D
$ K7 u8 J+ l- A! N; V比较着急，希望高人指点。谢谢~, E- N5 m; N* p8 ~7 f% r
+ o" N4 Q- i- S. `6 c
附原始文献提供的splinkerette PCR Protocol

图片附件: [splinkerette PCR] splinkerette PCR.jpg (2011-2-14 10:54, 29.76 KB) / 下载次数 468
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=MjE0Mjh8ZGFjZTMyNmR8MTc4MDMwMDY5Mnww



附件: Splinkerette Protocol.doc (2011-2-14 10:54, 136.5 KB) / 下载次数 12
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=MjE0Mjl8NjQ5ZGIwZjh8MTc4MDMwMDY5Mnww
作者: splinkerette    时间: 2011-2-14 11:13

LZ您好，首先我建议您参考nature protocol上的一篇文章：A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites，相比较而言我觉得更有参考价值  in Drosophila的那篇文章我就只做个参考。对于您的问题，当然是要先在胶上跑，再胶回收分别去测序的啦。希望对您有帮助
作者: splinkerette    时间: 2011-2-14 11:17

附上文章

附件: Splinkerette PCR-2.pdf (2011-2-14 11:17, 311.12 KB) / 下载次数 58
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=MjE0MzN8OWVjYzBhMTN8MTc4MDMwMDY5Mnww
作者: 钻石星辰    时间: 2011-2-14 11:29

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! c/ h" x2 v0 y( D1 ~# |0 T1 V6 O* X* q4 Z3 J' u/ G% j
谢谢您，这篇文章我有，不过后面的Sequencing Analysis没太弄明白就没深究了，没做过这方面的。。生疏一些，我再仔细看一看，不懂再请教您可以吗？
作者: splinkerette    时间: 2011-2-14 11:50

呵呵，谈不上请教。交流，交流哈
作者: 钻石星辰    时间: 2011-2-22 19:14

本帖最后由 钻石星辰 于 2011-2-22 19:15 编辑 # ]% w) y! `6 n# X8 u1 ^  F
3 O0 {% V* J6 l3 Z) ?; T  B, V
回复 splinkerette 的帖子
, q; N- |) m+ s, C- Q8 M8 i: m7 J
/ q) u9 Z# I4 f  X; G$ M; I; c你好，我看了那篇文献，出了后面高通量的测序方法没看懂其他基本没有什么问题了。因为我们的插入片段不会像病毒那么多，所以我们就直接电泳然后切胶回收测序就行了。
; A7 Y: |+ P$ S" j- \' w2 f, B4 I$ l
不过，我还有两个小问题：7 G, Q9 z# {# F& ~+ @) l
& R; {+ l! r- K9 e9 E" E
1. 不过发现文献中的genomic digest体系配比中有一个“Acetylated” BSA。
1 ?* m; H: x4 b1 q9 h7 f+ d! P这种BSA在NEB中有提供吗？还是就是一般普通的BSA？
( }" Z; ]8 R3 T* {  L# S( e3 d% S! f$ ^8 {! h# ]
（没有用过NEB的酶不好意思）
( c7 Z- x6 n1 c) F
: M. W3 @$ F1 `! \- J1 y2. 请问必须要用4%的胶来分离nest-PCR产物吗？其它浓度的可不可以？
% K* W/ e" ~1 `# y& ]1 \# H2 `( |7 c& B; F' X6 J7 H
作者: splinkerette    时间: 2011-2-24 01:33

回复 钻石星辰 的帖子
/ h- z( @4 c' S
) d% d/ ]. p" a/ F3 D  D你好，高通量的测序方法其实我也不大懂的，老板说那个都是让公司去做的。我也就不管了~所以我们也是按条带切胶来的。
2 E2 Y- s/ ^6 Q0 |6 }0 [- D! ?; s! a+ B/ O, Q
两个问题：! z0 l' a, V" D% u, d" `" O) h$ U
1.就按照酶切的那个酶 说明书里的酶切体系就好，酶的buffer里头就是含有BSA的，
0 k7 r, F. e- O8 R7 r) e至于文献中那个Acetylated BSA就没管了，无非就是一个环境嘛，酶起作用就OK。
* g# S& V" w* ~. G" i$ e' ~
4 k( i/ q& f, k! Y' W% d3 I4 d2.当然不是一定要那个浓度，而且4%的胶也挺不好操作的吧。。可以先弄个2%的胶试试条带大都在什么大小区间，然后再调整浓度好让条带分开，便于切胶* }! g2 w: I! y8 p  j( w' ~# C7 P
附上一个图吧：# X3 t1 x  a  J! d1 @. Q, |+ D


图片附件: 3340757437_6299c212cb.jpg (2011-2-24 01:29, 57.09 KB) / 下载次数 333
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=MjE5NzV8NTU1ZmY0M2V8MTc4MDMwMDY5Mnww



图片附件: 3341677808_daeb8674d1.jpg (2011-2-24 01:32, 51.27 KB) / 下载次数 348
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=MjE5Nzd8Y2UxMjMzN2F8MTc4MDMwMDY5Mnww

作者: splinkerette    时间: 2011-2-24 01:36

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1 h% T: `) o7 E& C7 L
& l" P- p0 G9 [' m( |8 L% iP.S. 不好意思，积分还不够，所以还不能加好友和回复您的留言，抱歉。。。
作者: 钻石星辰    时间: 2011-3-9 19:35

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4 w& F- Y" ^: t$ `& X1 c$ B
5 R0 u! n2 h! v谢谢！最近在设计引物，请问splinkeretter引物是哪一端不磷酸化的呢？是GATC末端吗？
作者: jiabiaohu    时间: 2011-3-13 20:59

回复 splinkerette 的帖子" [4 f) p: [- u* w! `

/ S  h- S1 S7 k( B( J& K测序单上一般有PCR引物测序的，一般有两个选项，PCR纯化产物（即你跑电泳后割胶得到的），另外还有一个PCR未纯化，这个你也可以直接送过去，当你注明之后，测序公司会给你纯化的，当然测序费用可能要高些~~~
作者: jiabiaohu    时间: 2011-3-13 21:05

回复 splinkerette 的帖子* E+ X1 I1 p. S+ n6 U6 h# S

* s# t9 G. l  F: V7 Qsplinkerette  你好，看了你推荐的那篇文章，很详尽，有个问题想请教下，在这篇文章中，splinkerette 接头连接后，还有一步EcoRV酶切的过程，但是LZ的没有，当然分析来说两种方法都可以，但具体到结果上会有什么差别咯？
作者: splinkerette    时间: 2011-3-17 10:00

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3 ?! O) w- S/ D; ^
- D! P$ t$ Y3 v$ c9 \平时合成的普通引物，两头都是OH，我估计文章中所提到的不磷酸化，应该也是指5‘端的。不过这些个问题操作起来都不需要考虑的，直接把序列发过去合成就可以了
作者: splinkerette    时间: 2011-3-17 10:19

回复 jiabiaohu 的帖子
2 ]# |$ k5 H. e) d0 C! N
5 m( p) _- S9 K具体到结果上的差别我就也不清楚了，EcoRV 的酶切应该就是为了简化PCR的反应体系吧，或许能减少一些非特异性的反应。如果在你针对于“Transposable Elements”设计的下游引物之后有合适的酶切位点的话，我建议还是不妨一试。 不过至少我做的时候省略了那一步，也能出实验结果
作者: jiabiaohu    时间: 2011-3-17 12:21

回复 splinkerette 的帖子
3 ]8 p" ]+ y, e' v
; W& P$ ^8 J8 B( k我这个下游没有合适的酶切位点，所以方法可能和你的差不多咯~~~~ 能不能提供点详尽的资料（比如接头合成，具体实验步骤之类）咯~~~~虽然那篇文章很详尽，但还是怕出差错~~~另外，看到一篇protocol说Splinkerette PCR容易出非特异性带，不知道你的实验结果怎么样？
( d+ a, T4 a- X就等着这个结果毕业了，盼回复啊~~~~先谢过了。如果不建议的话，是否可以加QQ聊咯？我的QQ 348580917
作者: jiabiaohu    时间: 2011-3-17 12:25

回复 jiabiaohu 的帖子
4 u" q! f( P: y0 `& i7 Z2 S, R# F1 d
$ n7 K7 r" ~9 `6 M附件中是其他一些基于Splinkerette PCR 的改进方法~~ Isolation of Genomic Insertion Sites of Proviruses using Splinkerette-PCR based .doc (383.5 KB)

附件: Isolation of Genomic Insertion Sites of Proviruses using Splinkerette-PCR based .doc (2011-3-17 12:23, 383.5 KB) / 下载次数 19
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=MjMxNjR8NzNhYWNmZWR8MTc4MDMwMDY5Mnww
作者: jiabiaohu    时间: 2011-3-19 10:13

回复 splinkerette 的帖子: m6 o0 |. H) b. w+ ^. k9 E

* K/ D- p0 x) C& E合成的接头5端要加接头不？急~~~~谢谢·~
作者: splinkerette    时间: 2011-3-19 10:34

回复 jiabiaohu 的帖子; ?2 k. w- ~( Q1 H5 O6 n5 a

( f- [0 ~& H9 V! f4 z% {不好意思，我没有太看明白你的问题
作者: jiabiaohu    时间: 2011-3-19 21:43

回复 splinkerette 的帖子& _( N3 ?: i% e' O+ D6 A

: J1 d/ T3 _' ~2 K呵呵，不好意思咯，打错了，问题是“合成的接头5端要不要磷酸化”，后来查到了，好像是说不用磷酸化的，对吗？
作者: splinkerette    时间: 2011-3-20 09:26

回复 jiabiaohu 的帖子/ l3 G$ G& F; K0 y4 Y3 K& ?

( K+ `# c% w. B& [! u对的，像我之前说的那样，类似于合成引物那样，直接送出去合成就OK了
作者: jiabiaohu    时间: 2011-3-20 10:29

回复 splinkerette 的帖子# F$ z2 T. N7 m- N' `
! ]% {! R- \& t, H8 }
好的，谢谢咯~~
作者: splinkerette    时间: 2011-3-20 11:57

回复 jiabiaohu 的帖子
; _7 e( c/ l9 C4 L7 n  K  w2 M- e1 n# F. ]
呵呵，不客气，祝你实验顺利
作者: 钻石星辰    时间: 2011-3-20 16:43

回复 splinkerette 的帖子
' d. Z' U$ p7 B2 c1 v/ u1 J, S4 C4 ]( D7 G% ~3 m; l) v3 v+ I) O3 n7 {* ]
你好，请问我合成的splinkerette adaptor 没有按照Nature Method上要求的HPLC纯化，而是用PAGE纯化，对后续实验有影响吗？
) T2 y/ X7 s1 r/ E1 X+ o1 C3 Q! f3 ]8 U% @2 N
这两种纯化方式有什么不同呢？
作者: guotao    时间: 2011-6-21 09:02

可不可以用于转基因整合位点的检测呢？
作者: liulilin    时间: 2011-10-28 13:03

回复 guotao 的帖子+ e, i( _  v+ r& v
* M$ n0 o: `6 s( Z" e! q
现在我正在做转基因整合位点的鉴定，做三个月了 还是没有什么好的结果。痛苦ing
作者: 寒窗飞雪    时间: 2012-5-23 12:44

高通量测序的研究多不多呢
作者: 寒窗飞雪    时间: 2012-5-23 12:45

我对高通量测序比较感兴趣
作者: langziforever    时间: 2012-6-1 23:14

回复 钻石星辰 的帖子
7 O* i4 w/ [, n1 J% [$ g: p- k3 @# t; ?
PAGE胶纯化的效果要比HPLC的效果好呢！所以，肯定是没有问题的！
作者: langziforever    时间: 2012-6-1 23:19

回复 splinkerette 的帖子
( p; W, c% m# o5 A) k9 u- o- U; p3 E1 z7 g! V1 ^/ t) w
切胶主要是为了让测序结果更好一些，因为在一个等级的片段在上机测序时可以更好地控制时间，因为目前高通量测序都是要做类似于PCR的过程，这个过程就像PCR一样，不同的片段长度需要不同的时间，这就是为什么要切胶的原因，同时，你切的不同长度范围的胶也会让最后测序结果实际长度有个评价的依据，比如，50-100bp范围如果测出500bp的带，那么结果肯定是不可靠的，可能是污染。这也是为什么用4%的胶来分离酶切产物的原因，可以让条带分的更好更细！利于切胶。我觉得测序这块你懂这些应该就可以了，剩下就给公司做吧！只是你需要注意切胶和电泳时尽量小心，避免污染，因为高通量测序是很怕污染的！
作者: zerlardex    时间: 2015-4-22 09:52

学习了



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