英文的我有了，看不动！) f3 L4 @, d, P2 I
-----这个很简单的嘛，很容易看懂，慢慢看！如果就只是想说这类-语言的巨人行为的侏儒方面话的请慢走！- I, ~5 Q( {6 ] K6 G. r& T
最近要开始做实验了，头痛死了！作者: jefferson 时间: 2011-2-16 12:07
不同的细胞已及转不同面积的孔板操作起来略有不同，以转染六孔板的贴壁细胞为例： ) Z' {6 H# M) F( k& v g, v1．接种细胞。转染前一天将细胞接种至六孔板内。细胞接种数量视其生长速度而定，一般为1×106个细胞。转染时要求细胞汇合度为90~95%。转染前两小时对细胞进行换液。/ T/ T; J& u: ~' R( ^: h
2．将4ug的质粒DNA加至250ul的OPTI-MEM培基中，混匀。 ' `" l: d9 i* T. v( m0 D3．将10ul的Lipo2000加至另外250ul 的OPTI-MEM中，轻轻混匀，室温静置5分钟。: e7 W0 S0 C1 t$ e# o) h
4．将DNA悬液和Lipo2000悬液混合，总体积500ul，轻轻混匀，室温静置20分钟。 / [/ X; \( ~1 i5．将DNA和Lipo2000混合液加至六孔板的孔内，前后左右晃动孔板混匀，置于培养箱中培养。& h$ E" A! u% L8 F2 r% C/ ^9 K! V8 ?
6．转染4-6小时后，细胞换液，每孔2ml培基。8 D; o& w7 F8 w& s" P- o
7．转染18-48细胞后，收集细胞检测表达，或加入抗性培基筛选稳定表达克隆。 # Y' R! {) x( d4 I4 b3 q7 D+ r$ H! p, |6 ^. [; @" b
注：1. 如果没有OPTI-MEM培基，用培养细胞的无血清基础培基替代也可以。: H9 N, H( P- D5 r r% ]2 R
2. 该说明为一个孔的用量，同时转几个孔时按需加倍。若转染其他类型孔板，DNA和Lipo2000用量参见试剂盒说明书中的表格。可根据实际质粒和细胞的转染效率，分不同量摸索最佳DNA和Lipo2000的混合比例。 % A5 B! k3 j7 q/ E; b1 O& B) ^ 3．转染4-6小时后也可以不换液，但由于Lipo2000具有一定的细胞毒性，作用时间过长可能使某些细胞出现大量死亡现象，建议换液。) l* v0 C# B4 a 作者: 64627675 时间: 2011-2-16 12:28