干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: 极少量细胞如何做荧光定量? [打印本页]

作者: swxxx 时间: 2011-2-17 11:24 标题: 极少量细胞如何做荧光定量?

要收集外周血的肿瘤细胞做realtime-pcr（相对定量），但流式分选的外周血中的肿瘤细胞太少，只有几百个，我打算比较3个样本9个基因的表达差异。打算用微量rna提取试剂盒去提取它，不知道rna的量够不够用，还需要去测od值吗？（9个基因+1个内参）x 3个样本 x 做3个副孔=90个孔，不知道在这个过程中需要注意些什么问题。

作者: qingbao 时间: 2011-2-17 12:03

极少量细胞是多少？提RNA的效率有多高？最后RNA量有多少？这些你心里有数吗？建议还是要定量。
另外，实时荧光定量PCR技术是为了有效地解决传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此在进行检测之前要先得到标准曲线吧，这个过程会耗掉你比较多的RNA量。还有，正因为realtime PCR比普通PCR精确，所以阴性对照呈现阳性的几率很大，要求操作必须严格且熟练。不是那么好做的，如果想做一次实验就能得到重复性很好的结果，估计概率比较小。事先打击你一下，有个心理准备。

作者: 深海寂寞鱼 时间: 2011-2-17 13:57

本帖最后由深海寂寞鱼于 2011-2-17 13:58 编辑 6 G0 M: I% Q1 U( A0 ~
, G' w+ F- N5 }6 j5 s* z
回复 swxxx 的帖子7 E" {0 I- f/ g9 H( |4 o

To SWXXX站友：
; a" K! q) Z1 E- L  X  V! ?
   你一点都不要担心。其实这方面都已经有成品试剂盒销售了。
9 T- h% {/ e6 p' \
   你看一下TaKaRa的目录册就知道了。只需要几个细胞就可以用来进行real-time PCR.* X8 D+ r! f( ^0 {. u& [
3 g! y4 S; C% E( ~
   建议可能的话，把一本TaKaRa的目录手册放在床头，没事翻翻，不但能获得很多新的提示，而且对我们实验的一些细节设计也会有很大帮助的。（事先声明一下，我并非TaKaRa的拖）8 g& Y! i& ~6 d  ~  T3 ^

   我倒是担心你分选获得的细胞是否还是活细胞，能不能获得高质量的mRNA。
6 W* B2 |3 n# G5 Z/ _, V5 B
   另外，你也可以参考Michael F. Clarke小组2009年发表在Cell上的那篇miRNA-200c的文章。+ E4 s- `/ s, z. ?
他是把100个细胞直接分选到Tirzol里，然后用Real-time PCR检测miRNA的表达。虽然他们检测的是miRNA，但是其中的方法你是可以参考的。
& r7 \2 f( q4 k3 \
   当然这个实验的难度不会小。+ h' D$ E6 A5 k! V: F9 H5 t

如果你之前有丰富的RT-PCR或者Real-time PCR经验，那么对你来说摸索的时间不会太长。

但是，如果你是一个实验新手，或者有实验经验但是对于RT-PCR不能做的信手拈来。
  " T# t6 ~) r! D  s, i6 _, y
那么你可能需要一段时间对摸索。

当然啦，一切都是“小马过河”，只有你自己试了才知道。+ k7 X! i4 W0 N- \
3 J& R4 Q3 {: d! K, n8 k
祝你好运！

作者: swxxx 时间: 2011-2-18 10:12

太感谢了

欢迎光临干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)