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标题: 绵羊脐带间充质干细胞，让我郁闷的无文献摸索 [打印本页]

作者: 皮搋子 时间: 2011-2-17 23:46 标题: 绵羊脐带间充质干细胞，让我郁闷的无文献摸索

本帖最后由皮搋子于 2011-2-17 23:52 编辑 : n% T$ s( g7 X# F+ u9 [
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小弟开始做绵羊的脐带间充质干细胞了！

话说这绵羊的脐带和人的还真是不一样啊，人的脐带是一个手指头粗的管子，而绵羊是那种透明的黏黏的软胶包裹着4个管子。刚开始的时候没经验，第一根我就按照人脐带的处理办法把上面的粘液弄的干干净净，然后消化了之后我悲催的发现，啥都木有。。。3 a# p8 s8 w& K

第二回老实了，把那个黏黏的东西留着，据同事估计，这玩意就是华通胶（Wharton’s jelly），一次做了2根脐带。
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有一根脐带特别争气，别的细胞还在稀稀拉拉的长的时候，它5天就长满了一瓶子，175cm的大瓶子啊！！！！真给力！！！形态还特别好！！！
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它还长成了2层，没说的，直接1传10；
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消化的时候问题来了，上面那层胰酶3分钟就消化下来了，可是下面那层却是纹丝不动。两层细胞长的一模一样，我犯难了。

不管了，先把上面的细胞给分瓶了再说。: w/ L3 \' g# o  x% N5 d" V

回头再看瓶底的细胞，胰酶浓度0.25%直接上原液。10分钟后，终于下来了，现在我彻底傻眼了，到底上面的是绵羊的Msc还是下面的是？？？？
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我把下面这层也放起来培养着。。。' `+ f! ~' x9 \9 W" F9 S1 j
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目前寻找鉴定方法，因为我们没有流式细胞仪。不要劝我查文献，做绵羊脐带干细胞的小弟是第一人。0 o3 N. b  R3 e2 m+ x- _1 E
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就算是做表型鉴定，请问绵羊的脐带间充质干细胞哪些表达，哪些不表达？

好吧，上图吧。图片有点多，请耐心等待。8 ?4 X: d2 @& h/ _1 p, n

背景亮的是传代后的。" H' M" r5 Z3 m+ s7 }  m
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作者: tangyvhuang 时间: 2011-2-17 23:50

围观吧，不知道啊，

作者: siyue13 时间: 2011-2-18 09:56

占个楼，围观
皮兄，加油啊

作者: siyue13 时间: 2011-2-18 09:57

流式！流式！
流式！流式！

作者: 皮搋子 时间: 2011-2-18 10:01

回复皮搋子的帖子
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我会将做的时候遇到的事情一点点的写出来，给有像我这样误入歧途的同学提个醒：细胞是万恶的，干细胞是万恶中的万恶！
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比如那个脐带问题，人的是大约直径8-10mm的厚壁管子，按照教科书的办法就是把血管剥离下来，然后把组织给剪碎了消化。+ ]* X* K7 {7 ^* f9 K
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看到绵阳的我傻眼了，4根粗细大约有3mm的白色管子，上面裹着1mm厚的和果冻差不多的东西，用辅料镊一噜就干干净净，下面剩的东西酷似血管，你说我该怎么办？？？撕开？别扯了，这么细的玩意。

没办法，我直接给剪成碎片消化了，后来养细胞的时候细胞分成两层，下面那层难消化的我估计就是这个原因。9 j* t# S! \7 _

什么原因呢？别人做的时候是挑去血管，而我这由于不能肯定那个是什么玩意，所以直接消化，导致血管的内皮细胞上皮细胞什么的全部下来了，下面那层难消化的就是这个东西。这是我的推测啊。' A/ U" {7 c/ L" {( a

唉，焦虑啊，一个问题接一个问题的。
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明天我会出续集，讲讲下面我遇到的问题和我更大的焦虑。

作者: guosapphire 时间: 2011-2-18 10:33

建议直接做诱导分化试验，因为无论做流式还是免疫荧光，都需要有丰富且合适的抗体，绵羊估计这类抗体不多，即使有你也需要有订购等待时间，而且干细胞最为关键的地方在于其多能性，你是逃不过检验其分化能力的试验的。而且不同物种和组织的MSC其表面标记也会不一样，做流式的目的我想更多是为了描述你的细胞，但是要认定你的细胞是干细胞还需要证明其分化的多能性。4 @/ T4 N8 D# z5 O/ W5 Y
做脂肪分化和成骨分化都会有比较明显的表观特征，可以帮助你直观的掌握试验进展。, k9 R7 j) ?; r; Y# c3 k) t
一点拙见，希望对你有帮助。

作者: get0715 时间: 2011-2-18 11:35

我曾经也遇到过做从来没人做过的干细胞的实验，也很头疼，在此深表同情，哈哈！
如果你不确定哪些是华侬氏胶（Wharton’s jelly），哪些是血管，那你就索性把你说的外面黏黏的东西和里面的细管分开处理，看是否还会有长成两层细胞的情况。
你的细胞时原代时就长成两层么？多少天长成两层的呀？如果还有这样的情况，建议原代的时候早些传代，见有局部生长状态良好的时候就可以传代，一个小瓶传一个大瓶的比例，试一下。可能能解决你细胞分层的问题。) n+ }* U [/ k7 g; r1 G
羊的抗体应该很少，不过可能还是会找到的，那时我找抗体的时候偶尔会找到抗羊的抗体，先按人脐带间充质干细胞的表型先找两三个代表性标记试试吧。实在找不到，楼上的老师给的建议还是挺实用的，诱导分化的方法应该大同小异，还是很可行的，起码证明了是不是干细胞。
有不对的地方希望大家指出！共同进步！

作者: haoxinaok 时间: 2011-2-18 13:41

路过，学习！

作者: fengxuechunyang 时间: 2011-2-18 13:59

路过，学习了！赞成诱导分化，周期有点长，但是最能证明是否是干细胞。流式可以择机进行，但是还要选择合适的抗体。

作者: 皮搋子 时间: 2011-2-18 15:28

谢谢各位，我准备开始做诱导分化了。

作者: 皮搋子 时间: 2011-2-18 15:28

回复 get0715 的帖子7 [0 u# F F0 E3 ]5 ]$ S2 p% T
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第5天就长的密密麻麻分成了2层。

作者: get0715 时间: 2011-2-19 08:40

回复皮搋子的帖子
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接种密度大概在多少？这五天长的那么快么？

作者: hanbing 时间: 2011-2-28 00:11

我做了流式，高表达CD106 CD44 CD29 不表达CD45CD35CD71，基本判定是间充质来源的

作者: 皮搋子 时间: 2011-2-28 10:59

回复 hanbing 的帖子; g5 r# U, o. A$ Q: F5 u( I
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请问你也是养的绵羊间充质？能加qq交流嘛？

作者: hanbing 时间: 2011-3-1 23:48

回复皮搋子的帖子* U1 z A" J! q

QQ：1107148263

作者: pekingxiaoe 时间: 2011-3-6 21:06

我以前也想做羊的，可是做流式的时候有羊的那么多抗体吗？

作者: robort45 时间: 2011-3-7 15:29

一般粘性超强的，都属于分化了的细胞，不再具有干性，那个消化不下来的可能是巨噬细胞，而且你消化下来的细胞也要考虑是不是内皮祖细胞，要鉴定后才有说服力，可测测CD31，如果没有流式就用免疫显色之类的也行

作者: 细胞干 时间: 2012-4-26 21:13

回复皮搋子的帖子
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小弟最近开始准备做羊的脐带，但是不知道羊的脐带什么样？请问大侠能贴几张羊脐带的照片吗？

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