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标题: CIK的高效扩增技术 [打印本页]

作者: realinter 时间: 2011-2-21 16:09 标题: CIK的高效扩增技术

CIK细胞的数量对最后应用的结果很重要，在起始细胞数量不高的情况下怎么能够将CIK高效扩增是一个技术难题：3 D( G- u0 J! ~5 N# `4 m1 m
现有的方法：* d$ n* s5 a9 e4 u9 n
D0：IFN-r 1000u/ml- ~& t1 _& v7 v' }' Y; k, w" d& \
D1: IL-2 1000u/ml+OKD3 100ng/ml+ { J0 @( C O+ d
以后每两天补充IL-2 。
还有看到文章使用IL-1，IL-4等等的。: Y9 G1 {8 C ]
谁有更好的方法，欢迎讨论！

作者: get0715 时间: 2011-2-21 17:19

我知道的方法用的是CD3代替您说的OKD3。不好意思，您能告诉我一下OKD3是哪种因子么？

作者: deron 时间: 2011-2-21 20:20

回复 get0715 的帖子

CD3又称OKD32 A7 u9 j& p; H1 [

作者: deron 时间: 2011-2-21 20:22

回复 realinter 的帖子. I3 }- s0 B, M% J4 r a4 ?

多数文献报道说IL-2的量调至300U，也有介绍IL-1——100U/ml与IL-2——300U/ml共培养效果不错。就是没有实践过，不知道成效如何

作者: yunshi503 时间: 2011-2-22 22:42

改进的方法是用CD3包被培养瓶，然后再加入IFN-r、 IL-2 1000u/ml

作者: realinter 时间: 2011-2-23 15:52

回复 yunshi503 的帖子

恩，看过相关的文献，那这个用CD3包被的瓶子是第一天用还是第二天用呢？) S F$ Z) t# U% B, W8 x& }
怎么去包被瓶子呢？能分享具体步骤吗？谢谢！

作者: sky512829 时间: 2011-3-3 16:17

回复 yunshi503 的帖子& P' p2 }% H/ e! \' P

这个方法可以，我正在用

作者: sky512829 时间: 2011-3-3 16:19

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瓶子一般包被过夜用，如果急用可以包被4个小时左右，用的时候，直接倒掉包被液，用PBS或生理盐水清洗一遍，再用培养液清洗一遍就可以把细胞加进去养了

作者: sky512829 时间: 2011-3-3 16:22

回复 realinter 的帖子4 ]: R3 @5 P, ?$ L+ z

一般都是包被过夜第二天才用的，急用可以包被大概3,4个小时也可以了，用的时候倒掉包被液，20mlPBS洗一次，然后再用20ml培养基洗一次（175的瓶子）就可以直接加细胞养了

作者: sky512829 时间: 2011-3-3 16:24

回复 get0715 的帖子
. k7 ?9 }: ]# w- w; p* f
应该是叫OKT-3吧

作者: sky512829 时间: 2011-3-3 16:25

回复 get0715 的帖子

应该是OKT-3吧

作者: luomx07 时间: 2011-3-3 16:33

我养脐血CIK也一段时间了，其中因子IL-2 300u/ml+OKD3 50ng/ml，细胞在培养10天左右可以扩约30-50倍（有时100倍），可之后细胞停滞不长并趋向凋亡。很多文献说CIK可以连续长20天，可我养的那么快就凋亡。
盼望高手解答～～～～～～

作者: get0715 时间: 2011-3-5 08:17

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请教一下，包被液是什么成分呢？

作者: shangjianzhong 时间: 2011-3-5 08:23

提示: 作者被禁止或删除内容自动屏蔽

作者: realinter 时间: 2011-3-25 14:13

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; _! i6 v$ p4 z. a0 h9 ]1 F/ z# |" z9 G5 D
效果是不错,包被液还可以重复使用吗,这样倒掉好浪费的说

作者: 我是丁香 时间: 2011-4-27 22:41

免疫细胞培养种瓶的浓度很重要！

作者: 人医 时间: 2011-7-3 16:51

最重要的是IL-2，其它加不加都无所为，其次是单核细胞的浓度

作者: 人医 时间: 2011-7-3 16:52

何必搞得那么复杂

作者: 人医 时间: 2011-7-3 16:56

回复 luomx07 的帖子) P3 F1 ]/ _! s+ q1 K. n+ t) r2 C8 L7 ^
6 V- ]7 J( _. H' g7 V& D
如果经常是这样那是你的技术不行，培养一个月是不成问题的

作者: daitao 时间: 2011-9-10 15:39

能否发下用CD3包被过夜培养CIK细胞的文献啊！

作者: 我是丁香 时间: 2011-9-20 11:43

CIK的扩增数量与采集的本身细胞质量、培养基的品牌、因子的品牌浓度以及种瓶浓度、扩瓶浓度时机等都密切相关！但是从临床疗效的角度来看，细胞数量不是唯一的标准，细胞的数量、细胞的活性、与传统疗效的配合使用、临床疗程的制定、佐剂的使用都密切相关！

作者: realinter 时间: 2011-9-24 16:23

我这边刚刚做完了一篇文章是CIK表型和杀瘤性相关的，回头接受了就贴出来跟大家分享。

作者: txy_love 时间: 2011-9-26 19:16

目前有人用IL-15培养T细胞。

作者: Tonypan 时间: 2011-10-19 00:20

OKT3是CD3抗体的一个克隆号，并不是所有的CD3都是OKT3

作者: barley 时间: 2011-10-27 19:43

okt3是最早也是最广泛用于临床的CD3单抗克隆，临床级别的进口okt3非常贵。用CD3抗体包被板子的确是个不错的方法，但是如果技术体系不成熟，感觉有的时候不如直接加抗体效果好，现在有用CD3抗体磁珠进行刺激的，比包被对细胞的刺激效果更高，不过成本很高。

作者: menghy 时间: 2011-10-30 20:07

楼主贴的是经典的方案的了，我们实验现在用的也是这个方案，后面是用IL-2的浓度是500U/ml，CD3+50ng/ml，因为IL－2维持细胞CIK细胞毒性比较重要的因子，CD3是保证细胞持续增殖的因子。

作者: 晏子 时间: 2011-11-28 12:38

可以添加PHA，我培养的效果非常好！

作者: ly200101042 时间: 2011-11-28 13:06

试试加retronectin吧或者专门的培养液

作者: sun_daping 时间: 2012-2-1 11:27

养DC时我也包被过，但效果好像一般，我还用生理盐水包被过，效果差不多，不知道什么原因& x6 F; s9 x0 k U q7 w" k

作者: z0643115z 时间: 2012-3-21 10:09

用pbs包被2毫克的cd3隔夜，出来之后培养细胞效果好

作者: 莫邪小仙 时间: 2012-7-27 12:46

回复 deron 的帖子# s% I* W/ m1 B) C/ w$ \
! l2 W Y6 J3 E3 v5 S+ F
我们这边做的是IL-1和IL-2一起加的，在以后的换液中同时补充IL-1和IL-2，结果挺好的。

作者: 透明之蓝 时间: 2012-7-30 14:21

CD3单抗是OKT-3株的，IL-2可以按照计量的2倍甚至4倍来使用！！

作者: LL87 时间: 2012-8-20 20:54

是指新的培养瓶要包被用比较好吗？为什么呢？

作者: LL87 时间: 2012-8-22 22:51

回复 sky512829 的帖子

用什么包被培养瓶啊

作者: wwxx66 时间: 2012-11-10 16:00

回复 sky512829 的帖子

包被后，各因子的加入顺序是怎么样的？例如IFN-r，IL-2，IL-1a等，多谢！

作者: stang198651 时间: 2012-11-12 17:18

IL-2的量高了是不太好的哦，我一直用上海华新的IL-2，原来用1000u/ml，后来自己做实验对比，IL-2 500u/ml的时候比1000u/ml时增殖更快。Anti-cd3的间隔持续添加对于细胞的连续激活扩大扩增倍数是有益处的。固相包被Anti-cd3不一定比液相Anti-cd3好，液相Anti-cd3不一定比固相包被Anti-cd3差，这要具体到详细的培养方案吧。

作者: wwxx66 时间: 2012-11-12 22:16

一般文献都是用的IL-2为1000IU/mL，太高了不好，白介-2有副作用，量高了容易导致回输后的发热。一般用量为300-1000IU/ml.具体是固相包被好还是液相加好，我这个做的还不是很多，望高人指点！

作者: stang198651 时间: 2012-11-13 09:16

回复 wwxx66 的帖子0 u k# x8 b+ c3 D/ e: Y( Z
) @4 m- S& N+ U p9 K7 Q0 E- f
白介素2好像还没有用过固相包被的，都是用液相。另外养细胞用白介素2和临床直接给病人输注白介素2还是有区别的，养细胞制备制剂时离心洗细胞等操作到最后就只有细胞了，因子培养基等都被洗掉了，当然有些临床回输细胞时会在细胞制剂里加白介素2，或者临床回输细胞前输注白介素2.临床输注白介素2高了，是容易起副作用，所以白介素2最好从低剂量开始输注。

作者: sanmao85 时间: 2012-11-19 08:46

学习了

作者: 孙帅帅 时间: 2013-7-8 14:18

回复 sky512829 的帖子# E" O) r; y, f6 T( Y

请问你是怎么包被培养瓶的？用多少cd-3，多少浓度的cd-3？谢谢~~ 没养过免疫细胞，正在学习！谢谢！！

作者: 麒麟桃李 时间: 2013-10-24 11:02

DC-CIK细胞的制备方法. |4 o" D  ?1 E& b9 T5 i8 ?, I/ {
【背景】$ ?8 W) q# C0 W. i1 K
  CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。 CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-,IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群，其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。
DC是“Dendritic Cells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC是由2011年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家RalphM. Steinman于1973年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells, APC)。已证实，DC是唯一能够显著刺激初始T细胞(Naïve T cells)增殖的APC，而其它APC(如单核巨噬细胞，B细胞等)仅能刺激已活化的或记忆性的T细胞。DC是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中具有极其重要的作用。
   DC-CIK即DC和CIK细胞在体外共培养，然后回输给患者。严格的说，最终的效应细胞是经DC体外活化的CIK细胞。多项研究表明，DC与CIK具有协同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表达及抗原递呈能力均明显提高，而CIK的增殖能力和体内外细胞毒活性也得以增强，因此DC-CIK较单独的CIK治疗更为有效。若将肿瘤抗原负载的DC与CIK共培养，可刺激产生肿瘤抗原特异性的T细胞，这样的DC-CIK治疗则兼具特异性和非特异性双重肿瘤杀伤作用，比未负载肿瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更强，常被用于临床和科研。
【培养原理】/ J& H5 B# f# t+ E% `3 R- V
1．DC培养用细胞因子：9 X8 k+ D# `& ^8 w
GM-CSF( 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 ) ：, B: u- r! H. p9 }
  GM-CSF是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞的集落形成，并具有促进早期红巨核细胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的功能。GM-CSF是最早被鉴定出来对于DC有作用的细胞因子之一。GM-CSF在DC培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHC II类分子的表达得以提高，从而增强细胞的抗原递呈功能。此外，GM-CSF还可促进DC的存活。
IL-4 ( 白细胞介素- 4)
IL-4在由单核细胞诱导成DC的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC方向分化。若培养体系中不加IL-4，单核细胞将分化为巨噬细胞。同时，IL-4还有降低细胞表面表达CD14分子的能力。CD14表达水平的降低是单核细胞分化为DC的重要标志。GM-CSF和IL-4共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC(immature DC)，此时的DC具有较强的抗原摄取和加工能力，但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)，  但不表达CD14。
TNF-( 肿瘤坏死因子- )' P- Y" V+ d- [
TNF-可下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达，使细胞内MHC II类分子区室(class II compartment)消失，但能够上调细胞表面 MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)的表达，使未成熟DC分化为成熟DC(mature DC)，此时DC的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可极强的激活T细胞。
2．CIK培养用细胞因子和抗体：  " I3 L, {$ G* a" b( e" N
CD3 激发型单抗：
T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶 (Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸 (Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇途径或MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。3 L  ^' g) Y( J0 r0 H' u. ~; |
IL-2 ( 白细胞介素- 2)
IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。' ]6 S5 w& ^# N  J) K" J
IFN-( 干扰素 -)" r2 \# A5 p8 i: s# z- W' q2 z
IFN-;具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN- ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相关。先加入IFN-，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。
IL-1- (白细胞介素- 1) 　8 z' S$ w+ v* b  I7 h
IL-1也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1与IFN-和激发型CD3单抗合用时，可以明显提高CIK 的细胞毒作用。
【细胞制备】
1．外周血单个核细胞的采集
   1.1    用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞80 - 100ml；  u8 l: Z1 `8 V" ?1 m; x
   1.2    淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)。
   1.3    无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC，细胞数量需达到1-3 x 108。+ q( y: V& c0 \0 L
2．  ( 可选步骤) 肿瘤抗原的制备 ! |% ~* T4 t, Q1 K0 B
            用于负载DC的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或肿瘤相关抗原(Tumor-Associated Antigens, TAA)，也可以是肿瘤全细胞抗原。用TSA或TAA负载的DC具有很好可克服这些缺陷，因为此时无需知道那些抗原是肿瘤细胞的TSA或TAA，而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击DC可诱导产生针对不同抗原决定簇的细胞毒T 淋巴细胞(CTL)克隆，从而实现对肿瘤细胞的有效杀伤。肿瘤细胞全抗原负载DC的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载DC、用凋亡肿瘤细胞负载DC、用坏死或死亡的肿瘤细胞负载DC，用肿瘤活细胞负载DC，和将肿瘤细胞与DC融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞裂解液负载DC，因该方法简单、快速、有效。反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：; o/ G1 f, J* E8 T
      2.1    手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；
      2.2    无菌生理盐水洗3次；! F; s4 w' V9 G& y& @6 T5 G/ G) O1 P
      2.3    用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI 1640培养基，充分研磨；
      2.4    200目无菌网过滤后收集单细胞悬液；
      2.5    用RPMI 1640培养基重悬细胞至1-2 x 107/ml，装入5ml无菌冻存管中；
      2.6    将冻存管浸入液氮中速冻，10 min后取出，再迅速放入37oC水浴中解冻10 min。反复3-5次；, {/ q. d1 F5 ?) ], }
               注：也可以 -80oC/37oC 反复冻融 3-5 次。
      2.7    将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心10min；
      2.8    收取上清，0.22mm滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；- ^+ ]8 q9 I, X
      2.9    -80oC保存备用。
0 z+ x' Q3 {3 P
3细胞的培养及鉴定
      3.1    步骤1中获得的PBMC 用无血清培养液调整细胞浓度至2 x 106/ml，置于培养瓶内；- K6 }9 G* |) y5 U; q
      3.2    37℃，5%CO2培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁;
      3.3    收集悬浮细胞，． CIK用无血清培养液调整细胞浓度至1-2 x 106/ml；
      3.4    加入1,000 U/ml 的重组人IFN-g培养；* b3 W+ A4 P  l. B# L1 r
      3.5    24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；
                  注：此时也可同时加入 100 U/ml 的重组人 IL-1  。( y! v( v  E. @& _! Y3 ~, J% u6 c
      3.6    每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；
      3.7    在培养的第7d，收获CIK细胞，此时数量应达到1x 109个以上。
      3.8    CIK细胞质控：. \6 J- C3 U5 n* l. c! k2 K0 D1 G6 i/ z
               3.8.1  台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；" `5 ~  L' _, W1 t
               3.8.2  用流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8和CD56 等分子的表达，观察CD3+CD56+细胞的比例是否明
                           显提高。; c- k5 q) V" h3 W+ D. ~
) @3 D6 g" {$ {3 o2 W3 Q' e
4． DC 细胞的培养及鉴定1 j7 V, F  I( W( n
      4.1    步骤3.2中剩下的贴壁细胞(主要是CD14+的单核细胞)，加入含重组人GM-CSF 500-1,000U/ml和重组人9 r1 l; n) \/ a
                  IL-4 500U/ml的无血清培养液，37℃，5%CO2培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；
      4.2    每3d 半量换液一次，并补足细胞因子；
      4.3    (可选步骤) 在培养的第5d，加入步骤2中获得的肿瘤抗原50 mg/ml，对DC进行抗原负载；5 p. z6 v7 s7 v! c8 d& b$ _. i+ M
                  注：若不对 DC 进行抗原负载，该步省略。9 ]! O6 x& @1 [* U+ W
      4.4    在培养的第6d，加入重组人TNF-α(500U/ml)，诱导DC 细胞成熟；
      4.5    在培养的第7d或第8d，收获DC 细胞，其数量应达到1×106个以上；
      4.6    DC的质检：
               4.6.1  台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；( T$ O, X0 Q1 z1 v' V+ x  Y0 {
               4.6.2  流式细胞仪检测DC 细胞表面HLA-DR、CD83 和CD86 等分子的表达，以确定DC是否成熟。

5.    DC-CIK细胞的制备和质检; C: |8 S7 o' k  _( u
      5.1    收集步骤4和步骤3中所获得的DC 细胞和CIK 细胞，按1∶10 (数目比)的比例共培养，无血清培养液中添
                  加重组人IL-2 (300 U/ml)；
      5.2    每3天半量换液一次，并补加重组人IL-2 (300U/ml)。
      5.3    在第7d 收集细胞，细胞数量应达到1×1010个以上；* ~$ Z0 e; a+ a# C8 A3 M/ z6 B1 ?2 [# m
      5.4    DC-CIK细胞的质检：) W  X/ O* j) o3 e) U$ x
               5.4.1    台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；
               5.4.2    流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%' b0 k4 z2 v  F8 _
                              以上。6 k( R2 D/ ?2 q
               5.4.3    细胞杀伤实验：以DC-CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶
                              细胞，将效应细胞与靶细胞按10 :1(数目比) 的比例加入96 孔U型板中，每孔含靶细胞 1 x 1049 J: z. R9 t$ h1 @
                              个，终体积为200ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检
                              测效应细胞对靶细胞的杀伤率。3 G( f% h6 G, N0 t+ L+ B
               5.4.4    收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病7 R2 l% |; A7 A+ H  v
                              原学检测阴性，内毒素<5 Eu)。# X4 f1 L' H; M& b# @. I
【步骤简图】# E: H- _; Y* l5 X, q9 g

作者: winnerzyq 时间: 2014-3-17 14:22

OKT-3这个叫法对

作者: alance007 时间: 2014-4-18 10:29

OKT3就是CD3，克隆号来源的别称。据我所知，现在还有人用IL15,IL21,代替IL2

作者: shamoye 时间: 2014-4-25 16:12

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就是CD3

作者: shamoye 时间: 2014-4-25 16:14

回复 deron 的帖子, }) P- R& |! L6 R

IL-2生产厂家不一样效果不一样吧，文献上说300，应该是进口的我们用国产用1000单位/ml

作者: 指下人生 时间: 2014-5-5 16:45

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7 @$ s) x+ o9 q5 T1 s8 W$ C7 _5 s) T
是指克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗，可以刺激所有T细胞的增值

作者: zhrt 时间: 2014-5-30 10:34

回复 sky512829 的帖子& D' a, x3 {& ~# X* t! i C2 j5 i

如果只用PBS冲洗，会怎样呢？37摄氏度包被3-4h吧0 W% l# q: R6 d- Q1 g+ X

作者: gondobar 时间: 2014-7-20 22:38

包被后8^24小时内效果较好，所以可以提前包被。如果临时包被，可放置培养箱2小时。注意避光！PBS或者培养液洗两次都可以，考虑成本用pbs吧。因子貌似大家加的都差不多。

作者: yanglixia 时间: 2014-7-31 08:45

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请问包被CIK培养瓶用多大量的CD3还有别的抗体吗

作者: yanglixia 时间: 2014-7-31 08:45

回复 realinter 的帖子: j v/ x q5 l, f( e0 H5 p
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同样的问题，包被培养瓶，条件摸索中，求分享

作者: yanglixia 时间: 2014-7-31 08:46

回复 sky512829 的帖子, R& W6 p9 n5 f L5 s9 o3 C: t
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能分享一下具体方法吗

作者: yanglixia 时间: 2014-7-31 08:46

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培养瓶是如何包被的呢，去分享

作者: 张源 时间: 2014-8-28 10:33

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请问你那个r干扰素个白介素2都是什么时候加加到哪里？我们分离都没加白介素2 都是后来培养加液时候加的

作者: xiaolu19781999 时间: 2015-1-12 17:55

现在出现了一种链式激活的免疫细胞（CIK），先是包被瓶子，加上两种专利因子，第五天可以收获细胞，进行回输，效果还不错，

作者: Ivan0108 时间: 2015-1-15 16:45

我们D0就使用CD3+r-INF，D1使用IL-1+IL-2 细胞长的挺好，基本回输前细胞密度都在5.0以上了。

作者: lyj-0017 时间: 2015-1-15 17:06

回复 Ivan0108 的帖子& X" [/ J$ w7 u3 Y. ]3 r
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你说的这里面有个问题，我之前也用你说的D0加CD3+r-INF，本想D1天补加IL-2，但是，D1天观察细胞时，刚拿起培养瓶发现，细胞全部铺在培养瓶底部，轻晃培养瓶会出现絮状物，这是为什么？你们遇到过这种情况吗？

作者: cjsbaicai 时间: 2015-1-15 17:37

IL-4一般用在DC细胞的培养中，CIK细胞的话，常用的是IL-1α，IL-2，CD3单克隆抗体，INF-γ；当然，也有报道说，IL-7，IL-21，IL-10等因子的添加，对细胞培养有益处: B+ m% T. i+ K+ E5 y7 S8 A

作者: fsj1987 时间: 2015-7-9 13:30

我也正在养细胞，说的包被CD3是什么意思啊？可不可以说明白点啊

作者: stmcell 时间: 2015-7-9 15:34

我们是用CD3包被瓶子，培养液中加IL-2直接培养

作者: xnyyswzl 时间: 2015-7-9 15:44

OKT3

作者: luoan 时间: 2015-7-15 17:57

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跟我们做的一样

作者: yinxiaoguang 时间: 2015-8-28 14:04

准确的说应该是包被CD3单抗、或抗CD3抗体，OKT-3只是一个CD3单抗的克隆号，抗CD3抗体可与TC表面CD3分子结合，启动细胞内传导信号，引起细胞增殖。

作者: quanquan326 时间: 2015-9-15 14:10

D0可以添加IL-2诱导么

作者: 小猫狸狸 时间: 2015-12-8 15:50

一般用什么包被液呢？PBMC较少的时候包被效果会好一些？

作者: xingyanchao 时间: 2015-12-9 11:17

75cm2密封盖培养瓶中加入D-PBS缓冲液10ml，再加入5ug/ml CD3抗体，4℃孵育过夜，废弃包被液，用生理盐水+庆大霉素洗涤一次，再用无血清培养基洗涤一次备用。

作者: 细胞海洋 时间: 2015-12-9 20:55

回复小猫狸狸的帖子" p, W& p4 w. i/ k- w2 r; ?' L

建议你发新帖提问

作者: guanjun1314 时间: 2015-12-10 09:31

我们是IFN-r、CD3包被培养瓶，过夜后PBS清洗使用

作者: guanjun1314 时间: 2015-12-10 09:32

IL-2是在使用的培养液中加入用作补液用，持续用

作者: 刁萍 时间: 2016-1-11 09:56

IFN-r是什么？我用的是GT-T551. CD3和CD28，白介素2，方法是不是老了点？？求高人指点养CIK操作过程？？

作者: 细胞海洋 时间: 2016-1-11 11:55

回复刁萍的帖子3 c+ H9 [+ W4 k5 p! j. @
: Y+ M& u+ w4 e% o0 u
建议你发新帖提问

作者: quanquan326 时间: 2016-1-12 15:22

我是丁香发表于 2011-9-20 11:43 $ f! h3 d" F G1 u
CIK的扩增数量与采集的本身细胞质量、培养基的品牌、因子的品牌浓度以及种瓶浓度、扩瓶浓度时机等都密切相关 ...

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非常对，如果细胞生长不好，就不能够扩瓶太快。放置一段时间，适当添加一点IL-2刺激

作者: 鑫鑫向荣 时间: 2016-3-1 10:38

回复 Ivan0108 的帖子# E$ Y8 g: ]0 q& a

请问你们的白介素是1000u/ml还是1000iu/ml

作者: 小馬 时间: 2016-3-7 10:23

回复 realinter 的帖子2 k( i& Z5 c3 q5 K9 H: b

现在应该有了吧，求分享

作者: 我是传奇 时间: 2016-3-18 11:34

这个方法很一般啊，还浪费因子，这些浓度已经很多人优化过了，你这个浓度太高。还有高效扩增方法，用醇类。

作者: 石家庄 时间: 2017-1-13 17:32

回复 yunshi503 的帖子' n8 u* Y7 M* \+ w+ x

改进的方法是用CD3包被培养瓶，然后再加入IFN-r、 IL-2 1000u/ml 请问有相关文献吗？或者文章分享一下

作者: 阿秀哥 时间: 2017-1-17 09:49

我以前做的CIK就不用包被的，而且效果挺好的

作者: 剡溪兰客 时间: 2017-1-25 16:01

第0天就可以加CD3L了，量多一些

作者: 鑫鑫向荣 时间: 2017-2-6 11:03

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OKD3应该是D0天加吧

作者: zhengqingfu0621 时间: 2020-3-31 11:15

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就是同一种东西，叫法而已

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