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标题: 关于丝裂霉素处理MEF [打印本页]

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作者: wangyimei    时间: 2011-2-28 13:15     标题: 关于丝裂霉素处理MEF

还有一个问题就是关于丝裂霉素的配制和保存的问题
$ A' M; k. j  j. i: Y一 是不是得配成一定浓度的储存液啊，配完之后是避光四度保存吗，还是-20度保存，看说明书都是四度保存的，四度要是保存时间长了，是不是也会有降解？
7 u8 P0 }* n1 A1 @二是 我用10微克/ml的浓度处理3-4hours后，怎么看其是否还在增殖，只是用眼睛大概看一下细胞是否变密了没有吗？是否用做生长曲线来摸一下丝裂霉素C的浓度和时间？要是处理ICR MEF的话直接用文献上的浓度和时间是否可以，大家一般都是用的什么浓度和时间的？! Q7 g$ B. j4 W, `1 P& V  b. A' ^
三是 要是每次收集10ml的MEF-conditioned medium,一般是种多少细胞收集10ml的条件陪养液啊？

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作者: zerollx    时间: 2011-2-28 14:53

1、用DMEM 配成储存液、分装小管、-20度保存。用的时候取储存液用DMEM稀释至工作浓度，避光4度保存，最好在短期内用完。* J. u4 r0 T9 x: U6 U
2、一般10微克/ml的浓度处理2个半小时就可以了，刚做的时候不放心的话你可以处理后接种到皿后，观察几天其不增殖基本上就可以确定了，没有必要做生长曲线，当然若是在不放心的话可以做个曲线。一般这个条件基本上是不会有问题的。% i, _9 [' n6 \! e
    第三个问题我没做过，就回答不了了，但你若是收集MEF-conditioned medium，有一个很重要的一点是丝裂霉素处理后一定要洗干净，否则残留的丝裂霉素对ESC是有害的。

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作者: wangyimei    时间: 2011-2-28 20:21

恩，谢谢你的指导和解答，还有一个问题就是：丝裂霉素C处理后，用PBS洗5遍之后，是直接将ips细胞接种到上面，还是说将处理后的MEF用胰蛋白酶消化下来再以一定的密度接种到平皿中，待其融合至合适的密度后再将转导后的细胞接种其上？

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作者: zerollx    时间: 2011-3-1 19:07

都行，也可以一次用MMC处理很多的MEF后，冻起来，用的时候再接种合适的密度，待其贴壁后直接用，不过处理的MEF是有最佳使用时间的，最好在5天内使用。

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作者: wangyimei    时间: 2011-3-2 12:53

恩，好的

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作者: 你好好    时间: 2011-3-10 15:01

大家都是买的哪家公司的？
* J* c* j# n) ?; k- ?6 ?  A; i查到有SIGMA的，有两种，M4287和M0353" K# l" f9 ~" X' H7 z) F; G4 w

! V; ^  z1 m2 @4 G9 H  |( J大家都用那个货号？
- q% ^" g" N# b
$ `) b( A' a) V1 X) D8 Y

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作者: wangyimei    时间: 2011-3-10 15:44

之前我用的是SIGMA的，价钱昂贵，而且丝裂霉素最好是现用现配，对光也比较敏感，配完后要赶快用完；
7 P& [5 A) T# ~* V; s! y9 x7 e现在用的基本上都是从医院买的，几十块钱，用着还行

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作者: 573639471    时间: 2011-4-15 15:32

你好好 发表于 2011-3-10 15:01
; ?# Y& j1 R7 l7 \2 z+ t大家都是买的哪家公司的？
. ?+ G8 Y6 j1 C( I( r" w查到有SIGMA的，有两种，M4287和M0353

5 F' b! v$ f# i你好，你最终订的哪种啊，我现在订了M4287，以后多多交流吧

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作者: zsycgz    时间: 2011-4-15 16:31

我们用医院购买的，我们医院的2mg一支的，9.75元一支，不贵。今天刚买完。没必要这个也用sigma的吧？当然科研“富二代”例外。。。:D8 y  J: Z  T2 b- j; m& C, C
! |9 \2 [1 h2 I4 }7 l
补充内容 (2011-4-15 16:32):
% F" X" P$ t& X3 j  q$ R以前也一直用，效果可以啊

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作者: 573639471    时间: 2011-4-18 11:53

zsycgz 发表于 2011-4-15 16:31
- d$ a2 u9 ]! g9 K1 a& y: N* l我们用医院购买的，我们医院的2mg一支的，9.75元一支，不贵。今天刚买完。没必要这个也用sigma的吧？当然科 ...

4 n$ {1 F2 B$ F* T
我正打算从医院买，医院卖的只有一种还是有不同的标准，如果有不同的型号的，要选择哪种呢？

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作者: zsycgz    时间: 2011-4-22 16:29

常规就是2mg一支的。至于不同型号就不清楚了。其实只要是“mitomycin”就应该没有问题。

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作者: 573639471    时间: 2011-5-30 16:49

zerollx 发表于 2011-2-28 14:53 + L  _& q- j' Y
1、用DMEM 配成储存液、分装小管、-20度保存。用的时候取储存液用DMEM稀释至工作浓度，避光4度保存，最好在 ...

4 R2 v) m3 @3 N关于MMC配制，sigma的细胞培养级的粉末配成储存液必须过滤吗？

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作者: zerollx    时间: 2011-5-31 20:23

回复 573639471 的帖子
2 E  q% X8 u, U
4 |( \5 Z3 m$ K5 J嗯，0,22um的滤器过滤除菌！

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作者: Elaine韩    时间: 2011-8-29 17:31

回复 zerollx 的帖子
1 x4 I: k" G( \; |% [9 q9 c5 q. y, i% s4 y
你好！我想问一下，你们用的sigma的MMC浓度是10ug/ml 吗？+ g4 Y$ w/ D# a; @. M4 z# G
我们买的是浙江海正药业的MMC，用10ug/ml浓度效果很好！

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作者: dongxin    时间: 2011-8-30 08:44

回复 wangyimei 的帖子
& b) ]$ g& T; O9 N- a- ~! p8 z" Y. ^/ O* L% Q9 T8 y( [6 y# m
对于第三个问题，我做过35mm的皿（MEF）中加入1ml含有bFGF的培养液（针对于你要养的细胞的培液），此外MEF为5×10^6。供参考，祝好运！* K( y* ~7 B  d+ T

. G/ l; Q3 Z3 X- ~9 e, j补充内容 (2011-8-30 08:48):1 w0 ?( `4 z% S, i' q, l( x, c
在向皿中加含有bFGF的培养液之前一定要用PBS洗2-3次，以去除MEF中的血清和死细胞！

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作者: hygene    时间: 2011-8-30 09:42

回复 wangyimei 的帖子
( D& n# {3 |9 F( p1 y; x: j8 t, [* T& [) y) E/ ~
1. 直接用DMEM配成工作浓度，分装（1支5ml左右，1瓶的用量），-20°冻存，使用前根据需要量解冻。1 L$ J; Q+ {4 Y* K
2. 一般10微克/ml的浓度处理3-4h，关于细胞增殖可以有很多种检测方法。ICR的没做过，估计就3h左右。" m$ h+ Q+ z" y1 M
3.配制条件培养基的上清以正常细胞量接种就可以了，只是配制的时候注意跟新鲜培养基的比例，还有上清液中残留细胞要去除干净（可以通过0.22um滤膜过滤或其它有效方法）

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作者: 573639471    时间: 2011-8-30 11:08

回复 Elaine韩 的帖子
7 L- `- B# p- f9 ^- x
- }2 Q0 e* t- F$ G! B. E2 L我用的sigma的 10ug/ml 你买的MMC多少钱，也是这个浓度吧?

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作者: Elaine韩    时间: 2011-8-30 12:29

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% P  x  s3 ?& X1 G. O9 {! L* N, F7 g  |0 A. S# U
我们的MMC #M4287价格我不清楚，实验室别人买的，一直没用。
' J& j, F- k6 ^  V* C' s8 l我之前做的用海正的注射用的丝裂霉素效果挺好的，一直10mg大概50元左右，浓度也是用的10ug/ml，我最近查了一些资料，好像和MMC的牌子没很大关系，浓度都是10左右

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