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标题: 关于丝裂霉素处理MEF [打印本页]

作者: wangyimei 时间: 2011-2-28 13:15 标题: 关于丝裂霉素处理MEF

还有一个问题就是关于丝裂霉素的配制和保存的问题
一是不是得配成一定浓度的储存液啊，配完之后是避光四度保存吗，还是-20度保存，看说明书都是四度保存的，四度要是保存时间长了，是不是也会有降解？
二是我用10微克/ml的浓度处理3-4hours后，怎么看其是否还在增殖，只是用眼睛大概看一下细胞是否变密了没有吗？是否用做生长曲线来摸一下丝裂霉素C的浓度和时间？要是处理ICR MEF的话直接用文献上的浓度和时间是否可以，大家一般都是用的什么浓度和时间的？
三是要是每次收集10ml的MEF-conditioned medium,一般是种多少细胞收集10ml的条件陪养液啊？

作者: zerollx 时间: 2011-2-28 14:53

1、用DMEM 配成储存液、分装小管、-20度保存。用的时候取储存液用DMEM稀释至工作浓度，避光4度保存，最好在短期内用完。) o# |4 S* {: D; Q
2、一般10微克/ml的浓度处理2个半小时就可以了，刚做的时候不放心的话你可以处理后接种到皿后，观察几天其不增殖基本上就可以确定了，没有必要做生长曲线，当然若是在不放心的话可以做个曲线。一般这个条件基本上是不会有问题的。
第三个问题我没做过，就回答不了了，但你若是收集MEF-conditioned medium，有一个很重要的一点是丝裂霉素处理后一定要洗干净，否则残留的丝裂霉素对ESC是有害的。

作者: wangyimei 时间: 2011-2-28 20:21

恩，谢谢你的指导和解答，还有一个问题就是：丝裂霉素C处理后，用PBS洗5遍之后，是直接将ips细胞接种到上面，还是说将处理后的MEF用胰蛋白酶消化下来再以一定的密度接种到平皿中，待其融合至合适的密度后再将转导后的细胞接种其上？

作者: zerollx 时间: 2011-3-1 19:07

都行，也可以一次用MMC处理很多的MEF后，冻起来，用的时候再接种合适的密度，待其贴壁后直接用，不过处理的MEF是有最佳使用时间的，最好在5天内使用。

作者: wangyimei 时间: 2011-3-2 12:53

恩，好的

作者: 你好好 时间: 2011-3-10 15:01

大家都是买的哪家公司的？. k( ` |! x" G; F
查到有SIGMA的，有两种，M4287和M0353
6 i- T+ C8 E; e& p; t
大家都用那个货号？1 j& R# r; Y+ Q, B
% U/ G y' y: R; I: }6 c$ O+ e. h

作者: wangyimei 时间: 2011-3-10 15:44

之前我用的是SIGMA的，价钱昂贵，而且丝裂霉素最好是现用现配，对光也比较敏感，配完后要赶快用完；, Z4 O9 I9 F5 b# ?2 O c
现在用的基本上都是从医院买的，几十块钱，用着还行

作者: 573639471 时间: 2011-4-15 15:32

你好好发表于 2011-3-10 15:01 5 p$ e( o4 M! P% j0 L8 k$ U1 ~
大家都是买的哪家公司的？
! U" @+ y- i# q+ [查到有SIGMA的，有两种，M4287和M0353

你好，你最终订的哪种啊，我现在订了M4287，以后多多交流吧

作者: zsycgz 时间: 2011-4-15 16:31

我们用医院购买的，我们医院的2mg一支的，9.75元一支，不贵。今天刚买完。没必要这个也用sigma的吧？当然科研“富二代”例外。。。:D6 W" N3 z8 w& F; @4 i+ B
& _" X4 ~. @) c+ X- e9 Y$ E; ]! X
补充内容 (2011-4-15 16:32):! N7 m8 a6 e0 @9 |' J. t
以前也一直用，效果可以啊

作者: 573639471 时间: 2011-4-18 11:53

zsycgz 发表于 2011-4-15 16:31 5 ?* S* T" V7 i1 _8 G
我们用医院购买的，我们医院的2mg一支的，9.75元一支，不贵。今天刚买完。没必要这个也用sigma的吧？当然科 ...

我正打算从医院买，医院卖的只有一种还是有不同的标准，如果有不同的型号的，要选择哪种呢？

作者: zsycgz 时间: 2011-4-22 16:29

常规就是2mg一支的。至于不同型号就不清楚了。其实只要是“mitomycin”就应该没有问题。

作者: 573639471 时间: 2011-5-30 16:49

zerollx 发表于 2011-2-28 14:53 / W* Y2 C: R( Y: O0 G
1、用DMEM 配成储存液、分装小管、-20度保存。用的时候取储存液用DMEM稀释至工作浓度，避光4度保存，最好在 ...

) k6 Z( U" V, X+ x+ E
关于MMC配制，sigma的细胞培养级的粉末配成储存液必须过滤吗？

作者: zerollx 时间: 2011-5-31 20:23

回复 573639471 的帖子/ ^' ]" R* H; d1 ?, T

嗯，0,22um的滤器过滤除菌！

作者: Elaine韩 时间: 2011-8-29 17:31

回复 zerollx 的帖子3 ?# I9 [' {8 Y9 {7 n5 Q

你好！我想问一下，你们用的sigma的MMC浓度是10ug/ml 吗？
我们买的是浙江海正药业的MMC，用10ug/ml浓度效果很好！

作者: dongxin 时间: 2011-8-30 08:44

回复 wangyimei 的帖子
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对于第三个问题，我做过35mm的皿（MEF）中加入1ml含有bFGF的培养液（针对于你要养的细胞的培液），此外MEF为5×10^6。供参考，祝好运！
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补充内容 (2011-8-30 08:48):
在向皿中加含有bFGF的培养液之前一定要用PBS洗2-3次，以去除MEF中的血清和死细胞！

作者: hygene 时间: 2011-8-30 09:42

回复 wangyimei 的帖子1 }7 v' I2 j4 Y s' ^4 @! W
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1. 直接用DMEM配成工作浓度，分装（1支5ml左右，1瓶的用量），-20°冻存，使用前根据需要量解冻。
2. 一般10微克/ml的浓度处理3-4h，关于细胞增殖可以有很多种检测方法。ICR的没做过，估计就3h左右。7 x [: l* ]: F
3.配制条件培养基的上清以正常细胞量接种就可以了，只是配制的时候注意跟新鲜培养基的比例，还有上清液中残留细胞要去除干净（可以通过0.22um滤膜过滤或其它有效方法）

作者: 573639471 时间: 2011-8-30 11:08

回复 Elaine韩的帖子

我用的sigma的 10ug/ml 你买的MMC多少钱，也是这个浓度吧?

作者: Elaine韩 时间: 2011-8-30 12:29

回复 573639471 的帖子$ O( z2 s* U v8 ?4 s) Y
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我们的MMC #M4287价格我不清楚，实验室别人买的，一直没用。) {. j9 q, O j4 f" y5 C' D
我之前做的用海正的注射用的丝裂霉素效果挺好的，一直10mg大概50元左右，浓度也是用的10ug/ml，我最近查了一些资料，好像和MMC的牌子没很大关系，浓度都是10左右

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