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标题: 关于丝裂霉素处理MEF [打印本页]
作者: wangyimei    时间: 2011-2-28 13:15     标题: 关于丝裂霉素处理MEF

还有一个问题就是关于丝裂霉素的配制和保存的问题
' T8 K0 \% `$ @: s, q* ~一 是不是得配成一定浓度的储存液啊，配完之后是避光四度保存吗，还是-20度保存，看说明书都是四度保存的，四度要是保存时间长了，是不是也会有降解？
# d- H0 j, }; v1 E% J二是 我用10微克/ml的浓度处理3-4hours后，怎么看其是否还在增殖，只是用眼睛大概看一下细胞是否变密了没有吗？是否用做生长曲线来摸一下丝裂霉素C的浓度和时间？要是处理ICR MEF的话直接用文献上的浓度和时间是否可以，大家一般都是用的什么浓度和时间的？4 X- c- M) j, x8 U4 E2 a! k/ {
三是 要是每次收集10ml的MEF-conditioned medium,一般是种多少细胞收集10ml的条件陪养液啊？
作者: zerollx    时间: 2011-2-28 14:53

1、用DMEM 配成储存液、分装小管、-20度保存。用的时候取储存液用DMEM稀释至工作浓度，避光4度保存，最好在短期内用完。/ d& ?- w0 s- ?  t  R( b: p! G
2、一般10微克/ml的浓度处理2个半小时就可以了，刚做的时候不放心的话你可以处理后接种到皿后，观察几天其不增殖基本上就可以确定了，没有必要做生长曲线，当然若是在不放心的话可以做个曲线。一般这个条件基本上是不会有问题的。
( j. W# F9 W8 b0 d- f" ]    第三个问题我没做过，就回答不了了，但你若是收集MEF-conditioned medium，有一个很重要的一点是丝裂霉素处理后一定要洗干净，否则残留的丝裂霉素对ESC是有害的。
作者: wangyimei    时间: 2011-2-28 20:21

恩，谢谢你的指导和解答，还有一个问题就是：丝裂霉素C处理后，用PBS洗5遍之后，是直接将ips细胞接种到上面，还是说将处理后的MEF用胰蛋白酶消化下来再以一定的密度接种到平皿中，待其融合至合适的密度后再将转导后的细胞接种其上？
作者: zerollx    时间: 2011-3-1 19:07

都行，也可以一次用MMC处理很多的MEF后，冻起来，用的时候再接种合适的密度，待其贴壁后直接用，不过处理的MEF是有最佳使用时间的，最好在5天内使用。
作者: wangyimei    时间: 2011-3-2 12:53

恩，好的
作者: 你好好    时间: 2011-3-10 15:01

大家都是买的哪家公司的？
$ U4 p3 _# N( \+ Q9 F% U查到有SIGMA的，有两种，M4287和M0353
! h. @0 E7 V+ I+ j
* m( `; O8 w: Z5 R大家都用那个货号？
, B; g1 n/ d7 n# u9 o) Y  B& K
作者: wangyimei    时间: 2011-3-10 15:44

之前我用的是SIGMA的，价钱昂贵，而且丝裂霉素最好是现用现配，对光也比较敏感，配完后要赶快用完；
( L' A- Z6 X  j6 r. o" I% M; b现在用的基本上都是从医院买的，几十块钱，用着还行
作者: 573639471    时间: 2011-4-15 15:32

你好好 发表于 2011-3-10 15:01 2 m3 Q% W$ W+ b. b+ k
大家都是买的哪家公司的？6 z; }" _0 |: C# B2 V
查到有SIGMA的，有两种，M4287和M0353

; a9 k+ h' }$ A, @1 i你好，你最终订的哪种啊，我现在订了M4287，以后多多交流吧
作者: zsycgz    时间: 2011-4-15 16:31

我们用医院购买的，我们医院的2mg一支的，9.75元一支，不贵。今天刚买完。没必要这个也用sigma的吧？当然科研“富二代”例外。。。:D, |2 ?* P5 ]) ~
; n6 V9 h5 Z3 w" T: f% L( D: Y
补充内容 (2011-4-15 16:32):2 ?8 H4 K6 s8 Q* K
以前也一直用，效果可以啊
作者: 573639471    时间: 2011-4-18 11:53

zsycgz 发表于 2011-4-15 16:31
, h$ Y" @" j* F) s我们用医院购买的，我们医院的2mg一支的，9.75元一支，不贵。今天刚买完。没必要这个也用sigma的吧？当然科 ...

# l* d2 }& a! P" i" I* I. ^我正打算从医院买，医院卖的只有一种还是有不同的标准，如果有不同的型号的，要选择哪种呢？
作者: zsycgz    时间: 2011-4-22 16:29

常规就是2mg一支的。至于不同型号就不清楚了。其实只要是“mitomycin”就应该没有问题。
作者: 573639471    时间: 2011-5-30 16:49

zerollx 发表于 2011-2-28 14:53 : C1 {5 V* j2 Q3 }( E8 F8 V* Y
1、用DMEM 配成储存液、分装小管、-20度保存。用的时候取储存液用DMEM稀释至工作浓度，避光4度保存，最好在 ...

1 U1 ?  Q! d! o" H4 x" N8 `4 j& [3 ^关于MMC配制，sigma的细胞培养级的粉末配成储存液必须过滤吗？
作者: zerollx    时间: 2011-5-31 20:23

回复 573639471 的帖子
; y+ R9 Y: Z, e9 G$ M9 E5 V- c0 K( M4 o5 f& `: B. w4 G
嗯，0,22um的滤器过滤除菌！
作者: Elaine韩    时间: 2011-8-29 17:31

回复 zerollx 的帖子* g9 i* @7 Z( X) ^/ `5 [
% D5 r8 }% b) l1 i
你好！我想问一下，你们用的sigma的MMC浓度是10ug/ml 吗？) u- M1 W6 a4 {% m6 E9 }
我们买的是浙江海正药业的MMC，用10ug/ml浓度效果很好！
作者: dongxin    时间: 2011-8-30 08:44

回复 wangyimei 的帖子
* u6 `. X' ]  {+ T$ ~. V
' x/ u8 [$ l" Y2 L$ O8 Q对于第三个问题，我做过35mm的皿（MEF）中加入1ml含有bFGF的培养液（针对于你要养的细胞的培液），此外MEF为5×10^6。供参考，祝好运！  a4 j; U6 c' [7 S9 v5 U7 ~2 ^

& ^/ s4 l8 |0 a. `' v4 B7 w0 K补充内容 (2011-8-30 08:48):
3 S9 k& g$ `" i在向皿中加含有bFGF的培养液之前一定要用PBS洗2-3次，以去除MEF中的血清和死细胞！
作者: hygene    时间: 2011-8-30 09:42

回复 wangyimei 的帖子( B, X+ N5 Z0 d% D: C

! ?6 Q/ T: }5 S! m( |) U7 U1. 直接用DMEM配成工作浓度，分装（1支5ml左右，1瓶的用量），-20°冻存，使用前根据需要量解冻。
0 R6 L8 @# |7 c0 G# \0 m2. 一般10微克/ml的浓度处理3-4h，关于细胞增殖可以有很多种检测方法。ICR的没做过，估计就3h左右。
9 l6 ~) |/ k+ b2 V3.配制条件培养基的上清以正常细胞量接种就可以了，只是配制的时候注意跟新鲜培养基的比例，还有上清液中残留细胞要去除干净（可以通过0.22um滤膜过滤或其它有效方法）
作者: 573639471    时间: 2011-8-30 11:08

回复 Elaine韩 的帖子) z4 w+ D8 M# ~) J5 o0 v

+ [, S/ l& \5 E我用的sigma的 10ug/ml 你买的MMC多少钱，也是这个浓度吧?
作者: Elaine韩    时间: 2011-8-30 12:29

回复 573639471 的帖子1 D7 A" h' D/ J3 ~: n0 ~! N/ G

) V' q7 V+ `6 ]+ G' F我们的MMC #M4287价格我不清楚，实验室别人买的，一直没用。6 Q/ ~; }& ^) X4 w
我之前做的用海正的注射用的丝裂霉素效果挺好的，一直10mg大概50元左右，浓度也是用的10ug/ml，我最近查了一些资料，好像和MMC的牌子没很大关系，浓度都是10左右



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