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标题: 关于丝裂霉素处理MEF [打印本页]
作者: wangyimei    时间: 2011-2-28 13:15     标题: 关于丝裂霉素处理MEF

还有一个问题就是关于丝裂霉素的配制和保存的问题4 h9 g- J6 v2 q) s
一 是不是得配成一定浓度的储存液啊，配完之后是避光四度保存吗，还是-20度保存，看说明书都是四度保存的，四度要是保存时间长了，是不是也会有降解？
0 a  d% G! ^' s) Z  g- B, p  \二是 我用10微克/ml的浓度处理3-4hours后，怎么看其是否还在增殖，只是用眼睛大概看一下细胞是否变密了没有吗？是否用做生长曲线来摸一下丝裂霉素C的浓度和时间？要是处理ICR MEF的话直接用文献上的浓度和时间是否可以，大家一般都是用的什么浓度和时间的？# g4 ?% y* o4 K8 j! K5 n6 \
三是 要是每次收集10ml的MEF-conditioned medium,一般是种多少细胞收集10ml的条件陪养液啊？
作者: zerollx    时间: 2011-2-28 14:53

1、用DMEM 配成储存液、分装小管、-20度保存。用的时候取储存液用DMEM稀释至工作浓度，避光4度保存，最好在短期内用完。* A) Y# X7 T) \* ?
2、一般10微克/ml的浓度处理2个半小时就可以了，刚做的时候不放心的话你可以处理后接种到皿后，观察几天其不增殖基本上就可以确定了，没有必要做生长曲线，当然若是在不放心的话可以做个曲线。一般这个条件基本上是不会有问题的。
0 L. _( K2 m+ L) A" m4 d" o    第三个问题我没做过，就回答不了了，但你若是收集MEF-conditioned medium，有一个很重要的一点是丝裂霉素处理后一定要洗干净，否则残留的丝裂霉素对ESC是有害的。
作者: wangyimei    时间: 2011-2-28 20:21

恩，谢谢你的指导和解答，还有一个问题就是：丝裂霉素C处理后，用PBS洗5遍之后，是直接将ips细胞接种到上面，还是说将处理后的MEF用胰蛋白酶消化下来再以一定的密度接种到平皿中，待其融合至合适的密度后再将转导后的细胞接种其上？
作者: zerollx    时间: 2011-3-1 19:07

都行，也可以一次用MMC处理很多的MEF后，冻起来，用的时候再接种合适的密度，待其贴壁后直接用，不过处理的MEF是有最佳使用时间的，最好在5天内使用。
作者: wangyimei    时间: 2011-3-2 12:53

恩，好的
作者: 你好好    时间: 2011-3-10 15:01

大家都是买的哪家公司的？% b6 \" {+ U9 ?1 p+ G! C. p7 n! n
查到有SIGMA的，有两种，M4287和M0353
: F  B" F+ L( Z5 e
( B" P/ g- Q: p" B6 @% n大家都用那个货号？
$ {, j" Q2 j  ?7 x
9 }. z! q) G4 a+ d& W
作者: wangyimei    时间: 2011-3-10 15:44

之前我用的是SIGMA的，价钱昂贵，而且丝裂霉素最好是现用现配，对光也比较敏感，配完后要赶快用完；0 o7 ]3 N$ ]$ H/ t9 g" i
现在用的基本上都是从医院买的，几十块钱，用着还行
作者: 573639471    时间: 2011-4-15 15:32

你好好 发表于 2011-3-10 15:01
0 m9 t3 _' U1 e& U9 ~: J大家都是买的哪家公司的？
; t3 V1 @0 j0 k* v' j查到有SIGMA的，有两种，M4287和M0353
! z; g3 K# P) g4 z
你好，你最终订的哪种啊，我现在订了M4287，以后多多交流吧
作者: zsycgz    时间: 2011-4-15 16:31

我们用医院购买的，我们医院的2mg一支的，9.75元一支，不贵。今天刚买完。没必要这个也用sigma的吧？当然科研“富二代”例外。。。:D
* f% Z0 }1 ^/ L3 R+ E$ E9 G: c& N, d. o  ^; c4 l4 H& i
补充内容 (2011-4-15 16:32):% Q, ~- V2 _8 |% e
以前也一直用，效果可以啊
作者: 573639471    时间: 2011-4-18 11:53

zsycgz 发表于 2011-4-15 16:31 2 q7 V0 W* B& l
我们用医院购买的，我们医院的2mg一支的，9.75元一支，不贵。今天刚买完。没必要这个也用sigma的吧？当然科 ...

  Y1 u* M+ [! S* z, Z我正打算从医院买，医院卖的只有一种还是有不同的标准，如果有不同的型号的，要选择哪种呢？
作者: zsycgz    时间: 2011-4-22 16:29

常规就是2mg一支的。至于不同型号就不清楚了。其实只要是“mitomycin”就应该没有问题。
作者: 573639471    时间: 2011-5-30 16:49

zerollx 发表于 2011-2-28 14:53
& r' y1 z4 n1 G$ i6 A8 q5 ^1、用DMEM 配成储存液、分装小管、-20度保存。用的时候取储存液用DMEM稀释至工作浓度，避光4度保存，最好在 ...
3 R4 t7 s' |  a# Q% ?# T
关于MMC配制，sigma的细胞培养级的粉末配成储存液必须过滤吗？
作者: zerollx    时间: 2011-5-31 20:23

回复 573639471 的帖子
0 {% H, I% ]6 a: E5 A/ r$ C1 \3 \9 s& E) d% m' g. n2 x7 Q
嗯，0,22um的滤器过滤除菌！
作者: Elaine韩    时间: 2011-8-29 17:31

回复 zerollx 的帖子8 x- ^: J* C# ~+ t6 _2 H
5 G* \% @" b$ G6 V
你好！我想问一下，你们用的sigma的MMC浓度是10ug/ml 吗？
. Z4 i9 J3 V5 }我们买的是浙江海正药业的MMC，用10ug/ml浓度效果很好！
作者: dongxin    时间: 2011-8-30 08:44

回复 wangyimei 的帖子! d3 z# r" E3 e" x! G1 o# `
$ n+ O3 r5 j9 p: l
对于第三个问题，我做过35mm的皿（MEF）中加入1ml含有bFGF的培养液（针对于你要养的细胞的培液），此外MEF为5×10^6。供参考，祝好运！$ u9 E/ y2 t0 A0 D

+ m& ?8 \/ e7 |补充内容 (2011-8-30 08:48):
: z$ \+ m. c: Q4 p! \2 S在向皿中加含有bFGF的培养液之前一定要用PBS洗2-3次，以去除MEF中的血清和死细胞！
作者: hygene    时间: 2011-8-30 09:42

回复 wangyimei 的帖子( D+ z1 c; V/ F8 g1 t* W# Y

' l% H" s" ?& U2 C/ h1. 直接用DMEM配成工作浓度，分装（1支5ml左右，1瓶的用量），-20°冻存，使用前根据需要量解冻。' _7 `* U) A6 k7 }5 p2 d; ]
2. 一般10微克/ml的浓度处理3-4h，关于细胞增殖可以有很多种检测方法。ICR的没做过，估计就3h左右。7 C6 r! Q4 L8 N) g& M+ S% O6 \" Q
3.配制条件培养基的上清以正常细胞量接种就可以了，只是配制的时候注意跟新鲜培养基的比例，还有上清液中残留细胞要去除干净（可以通过0.22um滤膜过滤或其它有效方法）
作者: 573639471    时间: 2011-8-30 11:08

回复 Elaine韩 的帖子$ \) m( r4 W; G' D+ _0 ^
' F0 ^, E+ z! a
我用的sigma的 10ug/ml 你买的MMC多少钱，也是这个浓度吧?
作者: Elaine韩    时间: 2011-8-30 12:29

回复 573639471 的帖子
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3 F2 b* e) j; \0 k/ s我们的MMC #M4287价格我不清楚，实验室别人买的，一直没用。2 T* r* G) i- g1 X6 p7 N
我之前做的用海正的注射用的丝裂霉素效果挺好的，一直10mg大概50元左右，浓度也是用的10ug/ml，我最近查了一些资料，好像和MMC的牌子没很大关系，浓度都是10左右



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