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标题: 关于转染 [打印本页]
作者: wangyimei    时间: 2011-3-6 12:16     标题: 关于转染

提高病毒的滴度，首先要提要转染的效率，在转染293T细胞的时候有没有什么特别需要注意的地方，每次做的时候转染效率忽高忽低很不稳定，请教一下大家
作者: wangyimei    时间: 2011-3-6 12:16

我用的是lipo2000
作者: qingbao    时间: 2011-3-6 15:27

lipofectamine 2000转染293T如果细胞状态好的话，转染阳性率达到70~80%应该是没问题的。如果保证操作平行的前提下，效率高低不稳定可能主要还是跟细胞状态有关，以前我转染的时候基本可以保持这样一个阳性率。
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按照2000的protocol操作就可以，主要的几点是：保证细胞状态、传代时间（保证转染时细胞处于对数期）、细胞融合度、转然后四五个小时换液减少毒性。# h: H4 k: t. e9 k6 z
还有一点就是protocol中的2000的用量其实是大大过量的，我们以前只用到建议用量的一半就足够了，有时甚至用到四分之一。减少用量除了可以减少费用之外，更重要的一点是，脂质体对细胞还是有一定毒性的，减少用量可以降低对细胞毒性。这个用量楼主可以自己做个梯度实验。对于293T细胞虽说成了细胞系后都有癌细胞倾向，但是相比较于其他的肿瘤细胞系，它还是相对脆弱的，要小心伺候才是，所以降低脂质体的量也有出于这方面考虑。
作者: amosummer    时间: 2011-3-6 15:28

首先可能和你的细胞状态有关系吧，一般好像都是在汇集度90%左右进行转染，效果会比较好。当然如果细胞长势比较良好，没有受到外界污染的话，应该效率也会高些。其次转染试剂应该也重要，脂质体转染可以比较稳定表达，但价格会昂贵些，而磷酸钙转染的瞬时效率还是可以的。这些转染试剂与细胞共培养时间也需要摸索吧。
作者: jiays    时间: 2011-3-6 16:47

293种板大约60%，24h涨到80-90%转染 ，效果一般很好，细胞最好在贴壁24h转，久了效率会随之降低，
作者: 张也行    时间: 2011-3-6 18:20

我用LTX PLUS 转的，按照说明书的用量，70%-80%转，效果很好。关键还是看细胞的状态。293贴壁不是很好，可以铺一层明胶，效果还不错... ...
作者: crystal    时间: 2011-3-6 21:15

哇，好漂亮的荧光啊！
作者: 一枝独秀    时间: 2011-3-6 22:38

回复 wangyimei 的帖子! W, L0 |* e( ?/ o4 k8 \. r; F8 x* I& Z, u

3 q4 z0 F  z2 H) x我认为293T细胞本身的状态最重要，最好控制传代代数在10代以内，细胞融合70-80%
作者: wangyimei    时间: 2011-3-7 08:21

恩，收获很大！谢谢大家！; q! z  K  }0 d
作者: wangyimei    时间: 2011-3-7 08:25

回复 qingbao 的帖子7 F4 ]! l7 Y5 S) v! H3 f; t
9 P1 c9 x$ t0 N
你好！呵呵，请教一下，你说的就是转染的时候按照lipo2000 protocol来做，而2000的用量可以减少到一半，你的意思就是说，譬如我用六孔板转染的话，质粒的用量还是按照protocol的4微克来加，而其对应的lipo2000的量就在说明书要求的用量上减半是吗？
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作者: jefferson    时间: 2011-3-7 10:12

张也行 发表于 2011-3-6 18:20
0 j1 H1 n0 k/ q/ w我用LTX PLUS 转的，按照说明书的用量，70%-80%转，效果很好。关键还是看细胞的状态。293贴壁不是很好，可以 ...

9 z& z6 q, H2 T/ f, l1 r有钱人, 呵呵
7 w* }/ N+ k& R5 y) _6 j. {  S2 p# s' [! Q' h( n+ A
LTX的效率比Lipo2000要高些, 同时毒性要小很多. 但是价格也贵几乎一倍
作者: qingbao    时间: 2011-3-7 12:34

回复 wangyimei 的帖子
  S; d* }1 }! d! `( G. E% G" T$ t+ ^8 H. p) g) D
对，我就是这样做的，没有问题。不过在你的系统里需要你自己做个梯度，看行不行。
作者: wangyimei    时间: 2011-3-7 23:05

哦，这样！
作者: ada800515    时间: 2011-3-9 15:45

不知道楼主用的是哪种质粒啊？我用 pmx-IRES-GFP的质粒，与pcl-eco和vsvg共转染293t细胞，也是lipo2000转染，怎么一点荧光也没有啊
作者: feelalone    时间: 2011-7-27 14:45

回复 张也行 的帖子. u" b3 I* {! i6 ^0 T5 `  V

  r2 Q% P4 k9 T. z# g) e+ Y5 [我想请教一下你用LTX PLUS的具体用量。。比如100ul的体系需要多少OPT-MEM 多少质粒 多少LTX 多少PLUS
作者: nibirucome    时间: 2011-7-27 15:26

回复 jefferson 的帖子
3 \) ^5 I  F+ l( c
, t8 H% h2 M$ O3 G4 D* @7 C" J* PLTX没那么贵吧，加了PLUS，转染试剂少用一半，算起来与2000差不多的！
作者: istephen    时间: 2011-7-27 15:43

LTX+PLUS 用量基本上减半 但是protocol上边写的依然过量
作者: 张也行    时间: 2011-7-28 11:39

回复 nibirucome 的帖子
8 e0 ]8 G+ r! b# w' e+ f: W: b6 \  W2 K1 G0 r% f, l# O& E; h
我基本都是按照说明书来的，没有减半。万一出了问题不好找原因...
作者: rexhz    时间: 2011-8-1 20:24

楼上的都是有钱人，我都一直在用磷酸钙来转，只要细胞状态好，用哪种方法都一样
作者: runsong    时间: 2011-8-1 20:47

我使用Fermentas的转染试剂，转染效率在90%，而且毒性小，价格公道，最关键是假货少。
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感染效率一般在80%以上
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6 P6 K: t4 z% Q, v1 n$ X2 G补充内容 (2011-8-1 20:48):
' M' Q# A8 N+ K" f4 i3 M4 P/ Y) Xhttp://www.fermentas.com/cn/prod ... -turbofect-in-vitro
作者: runsong    时间: 2011-8-1 20:53

我的攻毒效果
作者: song2086    时间: 2011-8-1 22:28

293细胞是很好的很容易高转染效率的细胞，用lipo2000转染细胞，1.必须在无血清状态下转染，因此必须用37度的PBS洗涤细胞，去除血清，2. 细胞生长状态要好，分裂增殖越快，转染效率越高。
作者: hhxxattxs123    时间: 2012-7-8 09:44

回复 张也行 的帖子
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请问用LTX PLUS 转染干细胞的实验你做过吗？之前用2000转染效率很低，不知道它的升级产品如何啊
作者: 张也行    时间: 2012-8-19 18:50

回复 hhxxattxs123 的帖子
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没用过LTX PLUS转染过干细胞，我们实验室做小鼠胚胎干细胞，一直用的是Lipo2000转染，效率到10%是没有问题。
作者: guokeliuhen    时间: 2012-8-31 00:30

回复 amosummer 的帖子
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/ {* V: o- X6 }90%的细胞汇合度太高了，因为用脂质体转染要预留细胞生长的空间的，要不然到转染后期细胞状态会很差，不利于病毒滴度的提高。一般80%左右比较好吧。还有就是楼主每次提取的DNA肯定会有差异，我们都是大量提取，分批次转染的，当然要去内毒素的。
作者: embryonic12    时间: 2019-10-4 11:01

我用Lipo3000向HCT116细胞中转染siRNA，效率只有不到10%。太低了。据说siRNA很好转染，效率可达80%。但我严格按说明书进行的。百思不得其解。请各位老师予以帮助。谢谢！



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