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标题: 请教如何去除多克隆位点？ [打印本页]

作者: 军医 时间: 2011-3-7 19:20 标题: 请教如何去除多克隆位点？

我想去掉载体上的原有的多克隆位点，在别的位置加上其他的多克隆位点，我用两种酶将原来的多克隆位点酶切后用klenow将粘性末端补齐，再用solution Ⅰ让该线性分子自连成环，大家看看这样做对不对？谢谢了。

作者: 深海寂寞鱼 时间: 2011-3-7 21:58

to 军医：
' |$ h" t( S/ N, [/ E
   设计没有问题。大胆做就可以了。: E" _$ Z8 a+ h2 C
) @& z0 ]3 W9 Q+ W% s) |
   几点建议：3 u/ k8 h; q0 Q8 f- ?

   1. 注意排除平末端连接后产生“移框”等影响表达的可能

   2. 平末端连接后是否会产生新的酶切位点

   3. 如果经济不存在问题，平末端连接完成后最好把连接部位测序。! ]1 a& U+ z$ T2 a
6 d8 j& W5 B7 a9 i- N/ S" b' R, F. Q
      因为有时候平末端连接后会少一个碱基或多出来一个碱基。
   （概率不高，但是确实会发生。绝对经验之谈。）
' d. k6 L! W0 D" g! M8 e2 a
/ p+ M* B% Q- J5 G1 }$ K7 \% _
   希望实验顺利。

作者: 军医 时间: 2011-3-7 23:48

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谢谢提供宝贵意见。

作者: 军医 时间: 2011-3-8 18:14

回复深海寂寞鱼的帖子

请问补平后的分子内自连要加连接酶吗？有人说直接将线性DNA转入感受态中便可以自动环化，这样可以吗，我用宝生物的solutionⅠ将它自身环化，转化后挑了六个单克隆，六个提出的质粒电泳显示大小都不一样，那pEGFP-C1作对照，CI比六个提出的质粒跑的都慢，让我很难解释。

作者: 深海寂寞鱼 时间: 2011-3-8 23:49

本帖最后由深海寂寞鱼于 2011-3-8 23:50 编辑

to 军医战友+ Z- d6 n6 F% k9 N( `+ U/ D

DNA确实有自连的可能性，但是几率不高，因此推荐你加入DNA连接酶。

你用环化质粒跑电泳，条带的位置确实变异比较大。9 p$ D) @" k% u
1 s# e" I& K' d9 n5 y8 L- Q
建议你用单酶切将你的质粒线性化，然后再跑电泳。

这样你就知道你的质粒是否正确。

作者: xiangchou812 时间: 2011-5-14 13:53

除了你说的用最外侧两个内切酶切割后再用T 4连接酶进行自身连接之外，还可以用同尾酶进行切割后再连接，比如：XhoI+SalI。另外用Klenow补平时要注意，其只能补平5'突出末端。自身连接的效率是很高的。
另外，环化的质粒电泳不好比较大小。还是线性化再比较吧。祝实验顺利！

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