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标题: Western Blot 封闭是用脱脂奶粉好还是用牛血清白蛋白好 [打印本页]

作者: yangjie0329 时间: 2011-3-8 10:29 标题: Western Blot 封闭是用脱脂奶粉好还是用牛血清白蛋白好

Western Blot 封闭有用脱脂奶粉的，有用牛血清白蛋白的（BSA)这两个哪个好呀，封闭多长时间呢，有说室温两小时，有的还过夜，封闭后加一抗前还用洗膜液洗吗，他们有说不用洗的，有说洗三次的，好晕呀，还有转膜时有用湿转也有半干转的，还有转膜电流怎么确定，大家相互交流一下。

作者: 小木梅 时间: 2011-3-8 11:22

肯定是牛血清白蛋白更好，封闭效果更好，脱脂奶粉便宜（脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆球蛋白标记的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素）；封闭的时间要看你封闭温度，我一般37摄氏度振荡半小时，或者室温一小时，或者4摄氏度过夜，这个可以根据时间安排选择，封闭后加一抗前可以不洗，因为有些人抗体就是用封闭液稀释的，没有必要洗，封闭是为了避免抗体与膜的非特异性结合。我们实验室用的湿转，电流大转移速度快，但也许转的不均匀，电流小时间会长，我一般200mA，2小时，具体时间要根据你的蛋白量大小，分子量越大转的越慢，如果时间太短或太长，要么没有转移完，要么转移过了，要摸索一下。

作者: aminhair 时间: 2011-3-8 12:05

效果来说封闭剂的种类很多。实践中感觉差异不大，但是偶尔也是显著的。封闭用血清一般要与一抗来源物种一致，这样能保证更好的封闭效果。但是大多数情况都用脱脂奶粉，BSA等。要看你稀释抗体的溶液是什么了。

作者: 张也行 时间: 2011-3-8 13:37

一般情况下 5%的脱脂奶粉就可以，试试就知道了，我一直是室温封闭2h，没有问题。一抗和二抗我用封闭液配的，没有出现什么问题。# B% O. x$ v, s _( `7 o
不过配封闭液的液体的pH一定要注意，我用PBS配的。不知道大家都是用什么配的。

作者: Chunjieliu 时间: 2011-3-8 14:05

BSA的价格比较贵，我们实验室一直用脱脂奶粉，室温封闭1到2个小时，效果也不错。我们的脱脂奶粉是用TBST配置的，浓度一般用10%的。封闭后不需洗涤，至于转模的条件要具体情况具体分析，如果目的蛋白的分子量为几十KD，我们一般采用120mA，1.5h。如果分子量较大，可适当延长转模时间。

作者: ghfvcat 时间: 2011-3-8 14:13

封闭时间无所谓，长点没关系，我封过两天两夜，周一来继续做，一点问题都没有

，至于BSA，好像太贵了点。加一抗前洗不洗无所谓的，直接用封闭液稀释抗体都行。孵上一抗或者二抗后一定要好好洗

作者: leisong12 时间: 2011-3-8 20:34

都说的挺对的，其实做Western没有一成不变的protocol，新手多请教下做的多的前辈就好了。感觉经验很重要。

作者: qdong108 时间: 2011-3-9 11:54

回复 leisong12 的帖子5 h- g( g' ]# _; M2 t& w3 r
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一般都用脱脂奶粉，5%-10%，1小时左右，转膜100kDa以下，1小时100V，就可以，分子量大，就延长到2小时，分子量小就短点，湿转哦。可以重复使用转膜液，3次左右没问题

作者: LiuRoc 时间: 2011-3-9 17:03

请问脱脂奶粉用什么牌子的？传说我们实验室的那一批还是拐了好几道湾才买到的。

作者: heather_lu 时间: 2011-3-9 20:06

BSA的效果当然好于脱脂奶粉。不过脱脂奶粉也很多种的，越单纯越好，含生物素的效果很差，杂交敏感度明显下降。

作者: yinglangbeijing 时间: 2011-3-14 00:55

300mA 1小时左右。可适当修改时间。摸条件情况时，可通过染胶，染膜，看marker的转印情况，甚至染滤纸的情况，来看转膜是不足还是转过了。 4 i* X. w, K3 X9 ] d
封闭，室温30分~1小时，我们做的一个小时。有见别人做40分钟的。
一抗可用封闭液稀释，二抗用PBST稀释的，呵呵。

作者: shewawa 时间: 2011-3-14 10:42

据说是和抗体使用情况有关，有的抗体不可以用5% skin-milk，要用BSA。但是据说skin-milk的blocking能力很强，出现非特异性band比较少。我们实验室用5% skinmilk RT 15min 或者4度 over-night,效果很不错，有兴趣的同仁们欢迎试用。本人做过很多次效果很好。

作者: btyou8u 时间: 2011-3-14 17:02

补充一句：杂磷酸化蛋白的抗体时，一定要用BSA封闭，而非脱脂奶粉。

作者: leisong12 时间: 2011-3-14 21:04

受益匪浅，感觉大家的经验都很丰富，谢谢

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