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标题: 求教：如何提高脂质体lipofectamine TM 2000的转染效率 [打印本页]

作者: mckf111 时间: 2011-3-8 10:55 标题: 求教：如何提高脂质体lipofectamine TM 2000的转染效率

各位前辈小弟现在做B16F10鼠黑素瘤细胞转染用的质粒是pIRES2-EGFP 脂质体是英骏的lipo 2000, S# Q( E6 k, U
先开始在六孔板接种大概长到70%左右行转染（因为此细胞消化后极易成团吹打N次也没啥用所以孔内细胞克隆很不均匀有的地方密有的很疏）过了36-40h后发现孔内大概只有5%-10%的绿荧光细胞而杂细胞基本铺满接着消化到其余两个孔过6h加G418（900mg/L）筛选过三天只有少许细胞死亡于是加压到1200mg/L 又过三天死了不少但是新长得也很多荧光显微镜下观察每孔大概只有1-2个阳性细胞于是放弃。。。
请问各位我应该在哪些步骤做如何改进能够提高转染效率而不至于筛选的阳性细胞太少？？？

作者: qingbao 时间: 2011-3-8 13:45

本帖最后由 qingbao 于 2011-3-8 13:49 编辑 ( y4 ]& K/ q) j) m) f
2 f1 x3 j; ]0 F* y6 Y) e2 \0 L
我看转染效率的问题大家已经在这个帖子里讨论了很多：http://www.stemcell8.cn/thread-35512-1-1.html。
用阳性表达5-10%的细胞来作稳定压力筛选还是有些挑战的。建议还是要把转染的阳性表达率提高上去再做后续筛选比较合适。另外做稳定筛选的G418给药压力是要事先做梯度的。给你一个我自己总结的protocol，看是否对你有帮助。

文档 2.pdf (27.45 KB)
本来想粘贴word的，但是表格会乱套。所以只能用附件，没有设下载包包的，不知最后是否需要你的包包。
又试了一下，给你贴图了，这样可以不需要下载就能看。% k6 [: |7 E! X% {6 t

附件: 文档 2.pdf (2011-3-8 13:43, 27.45 KB) / 下载次数 63
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=MjI3MjR8MjkyNjc5ZTZ8MTc4NzY3MTY4NXww

图片附件: protocol.JPG (2011-3-8 13:48, 99.68 KB) / 下载次数 464
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=MjI3MjV8NDU0NzZiN2V8MTc4NzY3MTY4NXww

作者: Chunjieliu 时间: 2011-3-8 13:58

脂质体转染某些细胞的效率较低，可以试着改变一下，脂质体与质粒DNA的混合比例，有文章指出当脂质体/DNA为1.25时，转染效率最高，楼主不妨试一下。

作者: mckf111 时间: 2011-3-8 14:50

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非常感谢再问下筛选前细胞融合度大概要多少合适？

作者: qingbao 时间: 2011-3-8 16:31

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1）在根据转染试剂说明书要求的融合度时转染，一般70%左右即可。）但是因为细胞生长速度不同，所以还要确定细胞转染48小时后或是新霉素筛选前才长满。因为生长接触抑制会降低目的基因的表达。3）确定细胞在转染后48小时以及药物筛选过程中生长状态良好。如果在瞬时表达阶段细胞不健康，可能是提示有潜在的毒性。3 P3 g# v. D/ G! G/ I& g( i
顺便再说几点要注意的：
1）得到的稳定转染细胞的荧光表达量会低于瞬时转染的细胞。因为瞬时转染时，质粒进入细胞后以游离的形式存在。目的基因的表达是通过细胞的转录与翻译机制进行的。一个细胞可能‘吞入’数个质粒，因此细胞间会存在差异。总的来说，稳定转染的细胞只含有1-2个被整合的质粒。; B9 [2 D7 Z5 A: E; L
2）做G418杀伤曲线。如果筛选用的药物太浓（不同批号间的药物浓度可能不同），选择压力过强。报告基因的表达水平与筛选抗性基因的不完全正相关，细胞在过高浓度的药物中生长，报告基因的表达反而降低。过高的药物浓度也可能影响了细胞的生长状态，进而影响报告基因的表达。这些副作用在长时间的筛选过程中尤其明显。筛选后的细胞培养，建议药物浓度降低为筛选时的1/2到1/5。6 k) ]: A& Y- X G- t+ s! [. m% U# i
3）总的来说，细胞培养时间在1-2个月内表达比较稳定，因此，建议分装冻存筛选过后的细胞，然后复苏原管，以确保细胞的统一性。, g. O ?* c4 _/ r0 t

作者: qingbao 时间: 2011-3-8 16:37

稳定筛选的原理：
被转染的质粒DNA带有可供筛选的标记基因，如胸苷激酶基因、二氢叶酸还原酶基因或者新霉素磷酸转移酶基因等。当携带相应抗性基因的质粒在被转染的细胞内表达后，用相应的抗性药物即可将转染细胞筛选出来。在真核细胞中以新霉素抗性基因比较常见。
新霉素抗性基因来源于转座子Tn5，其编码的细菌磷酸转移酶可使筛选药物G418失活。G418属氨基甙类抗生素，作用于80S核糖体可抑制蛋白质的合成。因此，未转染的细胞可被G418杀死，转染细胞却能够存活。真核细胞对G418的敏感性存在广泛差异。G418的使用浓度从100～1000μg/ml不等。所以，在使用G418筛选细胞之前，应将待试细胞置于含不同浓度G418的培养液中，以在3～6d杀死细胞的G418浓度为最佳。一般来说，细胞分裂越快，越容易被G418杀死。% P E0 H' c3 A, F* S

作者: crystal 时间: 2011-3-8 21:25

最近刚做了转染，有点小小的想法，不知道是否合理：' m1 I- A* {6 m Q3 Z i6 I8 D8 d
种板的时候，每孔细胞的浓度不一，这样等到汇合达到分别达到70%，80%，90%的时候进行转染，然后再根据转染效果看看，你的细胞在多少密度和汇合达百分之多少的时候转染率最高！再有就是分别调整DNA/LIPO的比例，你可以1/1.25和2/2这样做几个孔试试看，这样也许也能测得你所转染的最佳比例，自己想的，不知道对不对！

作者: mckf111 时间: 2011-3-9 08:44

回复 crystal 的帖子. {" z, }$ r6 R$ J. d4 c7 S
/ T6 C( H) k9 E) w: D
你的转染效率如何啊？

作者: fendou9 时间: 2011-3-9 16:28

转染还是要看具体情况的建议提高脂质体也质粒的比例

作者: crystal 时间: 2011-3-9 20:46

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大概80多的样子吧。

作者: mckf111 时间: 2011-3-11 21:39

回复 crystal 的帖子

什么细胞啊这么高的效率。。

作者: crystal 时间: 2011-3-11 21:53

回复 mckf111 的帖子; U4 y; N3 S6 q8 G3 T1 V; O+ r
/ s" R; U, q+ N" c
hela细胞，很好做的一个细胞株！

作者: runsong 时间: 2011-3-13 22:57

你为啥要用IRES载体，这种载体的GFP表达效率不高，而且转染两三天后可能会莫名其妙地失活。建议你用EGFP-C1做对照，再看看筛选效率如何。
转染其实没啥技巧，我感觉对于转染效率，脂质体质量、细胞种类状态、操作水平各占45%、45%、10%的权重。4 D; g! W& n( M
脂质体假货很多，三支中可能只有一支给力。呵呵，买试剂的都是奸商。

作者: xvmengdi 时间: 2011-3-31 15:22

我是一名新手，刚刚开始做转染实验，我想请教一个问题，用脂质体转染细胞后，细胞内会有黑点，我上网查呃一下，属于正常情况，可是转染24小时后细胞变成贴壁的粒状物质，想不明白这样的细胞还可以做荧光素酶报告基因实验吗？非常感谢~

作者: 细胞海洋 时间: 2011-3-31 16:45

回复 xvmengdi 的帖子% M7 F6 P4 `; Q7 v) W

建议你发新帖提问

作者: runsong 时间: 2011-4-1 22:05

回复 xvmengdi 的帖子# Q8 S9 s3 p f1 Q3 P2 E

细胞是不是死了，是不是用了假的脂质体

作者: 王乾 时间: 2011-4-2 13:50

转染的效率根本上还是由细胞种类决定的，有些细胞系好转，效率高，有些就不怎么好了。但是我们还是可以尽可能的提高转染效率，上面的战友讲过，细胞生长状态要好，这个很重要。另外，每种细胞系都有自己的最好用的转染试剂，要多看文献知道这种细胞系用哪种转染试剂最多。然后自己可以按照DNA和转染试剂的比例做个曲线，看看reporter的表达效率，做到最好的转染效率。其实DNA的质量也很重要，不仅仅是内毒素影响细胞的生存，一般情况下DNA超螺旋最好比列越高越好。为了促进表达，转染前线性化也可以（可能是这样，没有这么做过）。
6 {3 U; X! t6 Q+ X. j3 O
如果有些细胞系确实难转，就应该考虑其他方法了，电穿，病毒之类的。amaxa的nucleofector可以直接把质粒打到核里，很好用。

作者: 双刀 时间: 2011-6-8 20:28

细胞数少点对于转染效率的影响怎么样？

作者: bllx58 时间: 2011-6-9 13:08

建议把G418的浓度降低来进行压力筛选，然后梯度提高，这样效果很好，至少自己试感觉不错，相当于是一个梯度筛选，逐步筛选的过程

作者: huangcong1988 时间: 2011-12-23 10:57

提高转染效率可以从两个方面着手，一个是要转的细胞的状态，细胞一定要吹打均匀了，而且在接种的时候一定要使得细胞密度比较适宜，另一个就是质粒的质量，这个在提取质粒的时候选择好的试剂盒（或者说好的提取方法）一定要考虑清楚

作者: myjnqr 时间: 2012-1-4 19:15

细胞数少对转染的影响很大吗？我第一次在24孔板里做的时候转染效率80% 今天在六孔板做貌似没转进去的样子荧光颗粒还都在细胞膜上。

作者: huangcong1988 时间: 2012-1-5 10:38

回复 myjnqr 的帖子
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什么意思？六孔板不是比24孔板中每个孔的细胞数多么？你说的是细胞密度吧？转染时候不同孔板里面细胞密度都是确定的，可能在你接种的时候你没有进行细胞计数，也没有注意细胞汇合度，一般在接种后，细胞长到大约80~90%汇合度的时候进行转染

作者: xuyq706 时间: 2012-1-12 08:47

转染时细胞的密度与状态，质粒提取的质量与浓度，细胞的类型都会影响转染效率，上面有人说过DNA与脂质体的比例问题，之前没有注意过，参与论坛收获还是蛮大的！

作者: myjnqr 时间: 2012-2-3 15:50

回复 huangcong1988 的帖子0 t/ F0 z3 l& ~0 _" q K

在24孔板里转染效率80%，在六孔板里没转进去（当时接种密度是1*105），接种密度虽然有点低，但是也不应该都死了呀。

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