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标题: 请教mi-RNA茎环法设计引物 [打印本页]
作者: runsong    时间: 2011-3-11 16:21     标题: 请教mi-RNA茎环法设计引物

预用stem-loop法做RT设计micRNA引物，网上和文献里找到了两个版本的，不太一致。
5 a0 @. y4 v6 g版本一：查到以mir-145为例的帖子
# Q+ o; y: B+ s& ]              反转录茎环引物固定的序列为：5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3，再在后面加上目的miRNA成熟体从后面数八个碱基的反向互补序列。
0 G( U. R3 C$ x; {- x5 `# J              PCR正向引物固定的序列为：ACACTCCAGCTGGG，在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列。1 d2 @; ~. x" ]  I/ O6 z, z3 R
        PCR反向引物为：TGGTGTCGTGGAGTCG
/ v1 n+ S% {4 c; S: |4 b版本二：应用似乎更加广泛
) ^" ?* m: G% A0 V: \9 s( O              反转录茎环引物固定的序列为：5-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3，再在后面加上目的miRNA成熟体从后面数六个碱基的反向互补序列。* P( L9 h  b3 p
5 L3 K- y3 l/ y4 z2 R4 e. m7 Y
              PCR正向引物固定的序列叙述含糊，多为成熟体去除后面2-8个碱基而剩下的序列。7 E; F% S* `) `# ?  v2 J1 F
              PCR反向引物为：GTGCAGGGTCCGAGGT
7 e: t& V! f, e3 h( N0 J: C困惑ing...
. j" G# g: J+ @3 J, D  q/ N8 c8 P/ W7 L* U, B" n: l. I
这两个系统原理一样，不知有何优劣。
8 P- ~9 J+ n) f' }- {7 R% |/ x" w: \9 T
作者: mckf111    时间: 2011-3-11 16:21

昨天才订购的第二种方法 下周应该有结果 你可以两个都合成试试 都是短引物 不贵$ G$ {$ x5 g; a8 ]. O  H& V
另外 请参考这篇文章method中我的标注部分  r( Q  P! `% V, W# S
09-07-引物在其中刘云婧MicroRNA-9 inhibits ovarian cancer cell growth through reg.pdf (506.72 KB)

附件: 09-07-引物在其中刘云婧MicroRNA-9 inhibits ovarian cancer cell growth through reg.pdf (2011-4-13 20:46, 506.72 KB) / 下载次数 168
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=MjUwNzF8M2Y2ZGVkMmF8MTc5NDMwMjMzNnww
作者: runsong    时间: 2011-3-12 19:56

预用stem-loop法做RT设计micRNA引物，网上和文献里找到了两个版本的，不太一致。1 n- |4 I  g6 z
版本一：查到以mir-145为例的帖子( C$ ?& ^* Z8 c; O( P9 n1 K
              反转录茎环引物固定的序列为：5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3，再在后面加上目的miRNA成熟体从后面数八个碱基的反向互补序列。
1 y( ^, h# O/ ?5 T) {7 g/ ]9 D              PCR正向引物固定的序列为：ACACTCCAGCTGGG，在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列。
# l+ F: X5 W; D9 n1 u+ k6 `3 n        PCR反向引物为：TGGTGTCGTGGAGTCG
& U) t3 S5 |8 T版本二：应用似乎更加广泛" O' J! d+ z3 d2 P2 M6 A( c% W+ T: w
              反转录茎环引物固定的序列为：5-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3，再在后面加上目的miRNA成熟体从后面数六个碱基的反向互补序列。( E' q9 ?8 h* |* W! ~/ F
              PCR正向引物固定的序列叙述含糊，多为成熟体去除后面2-8个碱基而剩下的序列。
+ |, R. {) ]4 |/ |              PCR反向引物为：GTGCAGGGTCCGAGGT. B7 S, |! V4 A2 f8 A. m: E* E- Z
困惑ing...0 Y; Z$ Y. m" |3 i3 X$ Y
( O" D, ~1 G9 v5 h5 [0 z
这两个系统原理一样，不知有何优劣。: z& S* L/ r/ G% L9 a* U2 n
/ Z" s$ G$ @: T: `
作者: runsong    时间: 2011-3-19 19:44

自己顶
作者: runsong    时间: 2011-3-25 19:10

悬赏没人要？！3 ^3 C$ n3 |' E( z% ~; p) n
作者: xuyq706    时间: 2011-4-12 16:23

我们实验室用的第二种方法，一个学姐告诉我的。至于各种方法的优劣，不清楚。
作者: tanguixiang    时间: 2011-4-19 11:18

有很多做小RNA荧光定量检测的公司技术手册上有很好很详细的技术介绍，可以到相关网站上去看看
作者: mckf111    时间: 2011-4-21 22:19

回复 mckf111 的帖子
6 ^  ]! z, a7 _, E
% d. G( E. D" ]# M( t, y" {  N我用第二种方法 已将miR扩出 但U6没有扩出 因为我在文献给出的引物基础上修改了一点 现在重购引物准备再把U6弄出来
作者: runsong    时间: 2011-4-27 13:27

回复 mckf111 的帖子7 r4 k7 ^. A! p# `: p
! @) t3 A! D& ^% b$ i* n1 Y8 m
可以用5s，要是你还没解决的话我把序列发给你
作者: runsong    时间: 2011-4-27 13:28

回复 mckf111 的帖子9 e: S" I! r3 Q, k* Z2 t' ~

2 H3 @* X) R6 J9 s第二种方法上游引物的通用序列是啥？
作者: mckf111    时间: 2011-4-27 19:01

回复 runsong 的帖子' d# b+ f4 S5 \6 A
. @7 C) ?; r/ u' J) F4 ?/ _% N
5S也可以做内参么 人和鼠可以共用同一引物扩吗
" R. ]  [8 n5 `  t引物序列是什么 还烦请指教
作者: mckf111    时间: 2011-4-27 19:07

回复 runsong 的帖子7 m0 }' n4 L( C0 {+ p  ^- _

8 l3 {: ?  R# M/ i4 c应该是5'-GCCCGC再加上15bp左右miR的5'端序列 注意把U改成T
作者: 王乾    时间: 2011-4-28 13:08

我们也是应用茎环结构的引物来定量microRNA。对于每一个microRNA，我们设计了三条引物：一条反向引物用于反转录，一条正向引物，还有一条通用的反向引物，同时用于pre-PCR扩增步骤和实时定量PCR步骤。特异的反向引物约42-44个核苷酸，其5’端的36个核苷酸序列是固定的，形成一个8核苷酸环和20核苷酸茎的结构，其3’端的6-8个核苷酸就与microRNA互补。正向引物长约25-32个核苷酸，在3’端有11-18个核苷酸与相应的microRNA互补，而剩余14个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。通用的反向引物为23nt，其中18个核苷酸对应特异反向引物的茎环结构部分，而5’端的5个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。
3 e+ e& P3 G4 C1 c. p  u
作者: gunther    时间: 2011-7-28 10:59

"而剩余14个核苷酸的Tm值高于65摄氏度"$ m- Z0 b5 _8 b3 o8 z
是这样吗？
2 e& \& ~% U9 J) c* M所以forward前面的4~6个nt序列总是不一样。
2 G; U- \2 S0 w
1 W7 c" D' @* m) `' esunsong最后找到答案了吗？我也想知道！
作者: gunther    时间: 2011-7-28 11:35


% @5 @' q. y( S$ V6 y* y/ f+ \3 F我看文献好像前面那段并不是通用序列，不同mir的forward都不一样，真的仅仅是为了改变TM值吗？
3 m" P6 B- z5 W  e2 L" b2 ?, U0 v* I) J* @9 `
另外，为什么前面一定要多一段序列呢？- e$ Z& O3 a' W$ a
作者: runsong    时间: 2011-7-29 13:05

回复 gunther 的帖子
$ p( i4 s- G, ~0 B& x9 u% r# C6 S
我最后没有按照王乾说的做，在设计上游引物时我只是在前面随意加上几个碱基，让整个引物的GC%平衡，退火温度在63——65度之间就行了，没什么问题。
3 g" l" J9 U( @& f其实应该注意的是反转录引物与上游引物之间不要有大于2bp的交叉。否则因为做完反转录后反转录引物的浓度依然很高，用这做PCR的话很容易会将反转录引物作为模板扩出来。我有过这样的教训。
作者: runsong    时间: 2011-7-29 13:15

回复 gunther 的帖子
8 Q& S/ O' X1 P  h1 C2 P4 E) a  [. B: ~/ f# k6 R. }1 c4 I
不同mir的forward的确都不一样，而且反转录引物也几乎都不一样。
2 o# J5 b" D. t) y% L0 _# R: b, lforward的主体其实就是被反转录引物占用6-8bp后mirna剩下的前面那一部分，当然也可以向后延伸1-2bp与反转录引物重叠，在前面我也会加上几个碱基，其理由我感觉就是为了改变TM值，与下游引物匹配。
/ H* u3 \5 W) `& k/ r这套系统的原则是：扩增MIRNA的特异性是通过准特异性反转录与特异性PCR两步实现的，这一点在扩增同一家族的MIRNA时尤为重要。要自己好好体会。
  p9 M6 V; j: g
+ |; r; @% p; t2 N呵呵，其实都是我自己一个人的观点，仅供参考。
作者: wolf1978    时间: 2011-8-16 12:07

我的建议：进行miRNA引物的设计具有一定的难度，与常规的引物设计差别较大，不是每个都能成功。最好能够选用公司现成的一些产品，包括TaqMan探针、burgle stem-loop引物等等，节省时间，把握性更大！
作者: foodmic    时间: 2012-9-9 09:58

如何设计特异的茎环引物啊？
作者: 细胞海洋    时间: 2012-9-9 20:17

回复 foodmic 的帖子" q* z0 H3 w+ ^0 r+ C( p2 F
- j; y( o9 H8 Y  G6 t9 M2 S4 n
建议你发新帖提问
作者: gan107mz    时间: 2013-11-18 11:35

学习了，多谢各位



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