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标题: 直接转分化（direct conversion）学习帖 [打印本页]

作者: tpwang 时间: 2011-3-12 15:36 标题: 直接转分化（direct conversion）学习帖

本帖最后由 tpwang 于 2011-3-12 15:43 编辑

再生医学的终极目的是修复机体伤病衰老的组织和器官，而组织和器官的基本单位是细胞，所以也可以说再生医学的基本目标单位是细胞。某些脊椎动物保有相当完善的器官再生能力，而哺乳动物只有某些器官和组织具有部分自然的功能性修复能力。重要的脏器如神经系统、心脏、肺脏、肾脏等似乎不具备有效的修复能力。因此，医学上只能借助外源组织和器官的移植。有了人胚胎干细胞之后，人们开始期待用这种具有无限分化潜能的细胞来造出机体所需要的细胞、组织甚至器官。而iPSC虽然来源与胚胎干细胞有不同，但临床治疗应用的思路是一样的，也属于一种外源性制造和应用的途径。* p: {/ t. T5 k, j

胚胎干细胞和iPS的优势是多潜能，而弱点都是过程太长，风险相应也大,到现在很多关键问题也还认识不深。人们同时也在设法绕过这个多潜能阶段，直接将成熟细胞转化为另一种成熟细胞，即直接转分化。直接转分化的细胞来源与iPS类似，但只能是特定来源细胞或靶细胞范围的现象，而非胚胎干和iPS具有普遍意义，可以用一种来源指向多种目标。但胚胎干和iPS不可能实现而直接转分化所具有的一个潜在前景，是体内的直接转分化，亦即采用某种手段，在体内将某种细胞转化为所需要的靶细胞。这个前景的相对好处是显而易见的，它不存在体外操作的复杂性，也可能相当程度上规避了倒退回多潜能状态所需要的步骤带来的风险，如成瘤性。8 B+ y9 P+ R  r$ c5 [; W
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从认识细胞的可塑性亦即重编程以及生物发育过程而言，胚胎干细胞和iPS是非常关键的技术平台，但体外得来的结果只能用于“推理”体内相应的过程。而直接转分化，尤其是体内直接转分化，则应该对了解和应用生物可塑性有独特的意义，即通过直接在体内观察可塑性的程度、范围、命运及其应用价值。理论上来说，无论是体外还是体内，无论是胚胎干、成体干、iPS还是直接转分化，对细胞可塑性即重编程的透彻认识的终极意义，有可能是通过直接的体内干预来预防、减弱、修复、替换病变和损伤的细胞，达到防病治病的目的。从这个意义上说，再生医学的“再生”虽然听起来很给力，但词义上未必涵盖了基于生物可塑性的医疗终极理想，因为再生是(局部)伤亡之后的反动，而终极医疗健康的理念是防病于未然（两个层面上的意思：预先修补与防治恶化）。

从这个意义上来说，目前的干细胞研究，无论是哪一种，都还只是一个初级阶段。即便胚胎干实现了安全修复神经损伤、急性心肌缺血疾病、取代了糖尿病终身给药等，iPS实现了疾病模型模拟、药物筛选、个体化医疗应用，成体干细胞可以大量分离制备，甚至一些细胞的体外直接转分化技术成熟到可以解决某些特定病理状态，也还都是一个“治已病”的理念。好像是拿着包治跌打损伤的大力丸在杂耍场外等待出现意外。而如果能够在体内细胞层面直接干预、改变细胞的命运，不仅可以更方便地达到上述治已病的目的，而且有可能在透彻理解病理过程的情况下，有效预防或消除早期细胞病损、延缓衰老，甚至从细胞层面提升组织器官及身体机能。

听起来比较遥远，那是因为直接转分化的研究相对与传统的胚胎干以及iPS来说比较初步。初步是从研究的广度和深度上来说，而实际上直接转分化的现象的发现比胚胎干还要早，体内直接转分化的出现也基本上与iPS是先后脚的。这并不是说这些研究方向之间毫无关系或完全互相排斥的，而毋宁说是相互启发和推动的，正面的推动和反面的推动，即经验借鉴成果分享与接受教训趋利避害。iPS的出现在概念上避开了胚胎干细胞的来源的局限和伦理困境，而近来iPS本身具有的潜在不足和风险逐渐显现，有可能绕过这些风险的直接转分化开始出现一些新结果，尤其是跨细胞谱系之间的直接转分化。3 G; a8 k' u1 {

直接转分化的早期证据来自上世纪70年代末，有人发现可用某种手段将成纤维细胞诱导为脂肪细胞、软骨细胞和成肌细胞等，后来据此筛选出了著名的MyoD，作为一种调控肌肉细胞命运的主导因子。然后多个研究用MyoD将胚胎成纤维细胞、软骨细胞和视网膜上皮细胞转化为具有收缩功能的肌肉细胞。人们猜想这种可转化现象的原因是被转化的双方是属于同一胚层的细胞系，具有“亲缘”关系。由此思路，后来又有了特定因子将B淋巴细胞转化为巨噬细胞以及一系列血液细胞系内的转分化，内耳支持细胞转化为毛发细胞等。有人将这个transdifferentiation现象称之为“细胞谱系重编程”（lineage reprogramming）。既然是细胞谱系现象，那么逻辑的推理是这种重编程一定涉及早期发育过程细胞谱系分化的关键调控因子。7 p* ?. ~" l8 c: o' y- i) ^

较早细胞谱系内的体内直接转分化大概来自肝脏与胰腺之间密切关系的观察，有人用胰腺转录因子尝试在体内转化肝细胞为beta细胞，虽然获得了一些胰腺因子的表达，但未能获得功能性形态beta细胞。循着直接转分化有可能依托早期发育过程细胞谱系分化关键引资的思路，通过筛选出三个胰腺发育过程细胞谱系分化调节因子（(Ngn3，Pdx1 andMafa），Douglas A. Melton实验室于2008年在小鼠体内将胰腺外分泌细胞转化为beta细胞，实现了第一例体内直接转分化。当然，获得的beta细胞还不能形成胰岛而只是以单个细胞形式存在，因此影响其调控功能，这是另一个层面的问题。
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2007年有人将转化B细胞为巨噬细胞的因子（PU.1 and C/EBP alfa & beta)用于将人皮肤成纤维细胞转化为巨噬细胞，证明跨谱系的直接转分化是可能的。2010年有人采用三种心脏发育调控因子(Gata4, Mef2c and Tbx5)将小鼠心脏或皮肤成纤维细胞转化为心肌样细胞；用OCT4加特定cytokine，将人皮肤成纤维细胞直接转化为多种血液细胞，包括粒细胞、单核细胞、巨核细胞以及红细胞；三种神经细胞系特异转录因子(Ascl1, Brn2 and Myt1l)将胚胎和成体小鼠成纤维细胞直接转化为功能性神经细胞；一过性OCT4表达：人皮肤keratinocytes to neuronal and contractile mesenchymal cell types；顺便提及，2010年西北农大有人用视黄酸（维生素A）将小鼠成肌细胞转化为精原样细胞。1 I; O1 Q; V! q8 O3 ^
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2011年新年伊始，直接转分化成果的发表势头不减，有将线虫生殖细胞直接转分化为神经细胞；丁盛用一过性外源诱导因子（iPS四因子）表达加特定培养条件将成纤维细胞转化为心肌细胞；最近的一项研究在线虫体内直接将直肠细胞转化为了运动神经细胞，这应该是第一例体内直接跨细胞谱系的直接转分化证据。与此形成相对照的是2010年至今一系列对iPS潜在基因与表观遗传缺陷及其带来的潜在风险的研究。* G8 v. s6 J* A" W1 N* [8 q
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虽然人们认为这种成熟细胞之间直接转换“角色”的所谓“直接转分化”不同于iPS，即不需要倒回完全多潜能状态，但直接转换的机制是什么，除了非常概念性的想象之外，基本上还没有什么成型的模式。几个操作性的问题包括：（1）添加诱导因子与消除限制因子的作用；（2）一过性（部分）多潜能状态然后再分化；（3）解除部分成熟细胞表观遗传机制的问题；（4）是否经过progenitor状态；（5）有无细胞分裂发生；（6）特定诱导因子的作用机制（因子群内的互动关系）以及（7）体外直接转分化过程细胞内源因素与培养条件的外源因素各自起什么作用等。上述各研究由于采用的平台不一，方法不一，目标不一，结果也不一。但这些研究都将“不经过完全多潜能状态”作为是否直接转分化的检验标准。不经过多潜能状态的一个旁证是这些转化的效率通常比iPS过程本身要高很多，还不包括iPS再分化为指定靶细胞的效率。
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虽然概念上直接转分化有明显优于iPS的地方，但它不是一个具有普适性的平台，界定大量的成熟细胞之间转化的可能性、所需要的因子（群）以及操作方法将是一个很繁琐的过程，而且最终的结果只能是特定细胞之间（或乐观一些，具有细胞谱系价值的平台）。而且，理论上来说，成熟细胞的表观遗传稳固性应该远大于多潜能细胞，而目前对成熟细胞表观遗传知之甚少，如何克服这种稳固的表观遗传而又不倒回到多潜能状态，并重塑所需要的成熟靶细胞表观遗传，还需要大量工作。成体干细胞模型的一个关键问题是“微环境”（niche），体外直接转分化细胞的移植，以及体内直接转分化细胞的homming，都要面对如何达到微环境并能相互作用起到替代、修复、补充等指定的作用，这还是未知数。还可能包括端粒和端粒酶的问题，即来源于成熟细胞（已经有一定的寿命）的转分化细胞，如果不经过多潜能状态的可能重新恢复过程，其端粒和端粒酶是否也继承了源细胞的“遗留”状态。如果确实如此，那么这种已经“减寿”的细胞是否会有副作用。另一个相关的问题是源细胞的疾病状态是否能在直接转分化过程中得到有效修复，或者是否这种疾病状态会保留在靶细胞之中（如iPS疾病模拟所希望的那样），这种保留是否会对其靶细胞作用起到不希望的副作用。
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直接转分化技术也有与其它干细胞共同有的问题。包括分化成果的完整性（形态、功能、表观遗传变异程度、基因完整性、来源细胞记忆（iPS和直接转分化）、成瘤性、效率、临床标准细胞的筛选等。在这一层面上，所有的干细胞（细胞）治疗方法以及所有的重编程技术最终将受到实用标准的统一检验，也将最终决定临床应用价值。. _: K# U0 q1 w$ ]* B# B; |
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从理论上来说，直接转分化现象在生物可塑性（重编程性）上具有什么意义呢？核移植、多潜能干细胞（胚胎干和iPS）、成体干细胞，甚至肿瘤现象，都在某种角度证明了生物可塑性，也可以说都是某种程度的重编程表象。体外直接转分化如果无法在体内得到证明，则有可能是一种人为现象。如果在体内得到“重复”，那么就“有可能”是生物细胞所保留的一种重编程“潜能”。而如果能在生物体内直接“观察”到自然的直接转分化，那么就是一种重编程的现实。而这个现实在多大程度上多大范围内存留在何种生物物种，也是一个值得探究的理论和应用问题。/ c/ j. C7 I" N4 p  n  `
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如果畅想一下直接转分化尤其是体内模式的应用前景，应该是很吸引人的。在无数的可能情景中，适时修复或更新必要的细胞组织，以避免发展到疾病状态并适当提升细胞组织器官机能，应该是最有趣的。也许这不是最终的结果，而是从这个前景发展过程中衍生出了新的东西，也未可知。看看干细胞从血液到胚胎到iPS再到直接转分化，也许未来的现实图景是一个大“拼盘”，百宝囊，而不是一种灵丹。; ]- Z2 C0 ]  r. A( _

几个在直接转分化中常见的名称：Direct onversion强调不经过间接的中间（多潜能）过程；有人用direct reprogramming来表达直接转分化，但也有人用于iPS技术；transdifferentiation用的比较早，更偏重跨（trans-）不同细胞（系）之间的转分化；lineage reprogramming是表达这种重编程是细胞谱系内的现象，这是在还没有发现跨谱系转分化时的说法。如果现在要用这种表达的话，应该说
cross-lineage reprogramming（没见到有人用）。

列出近年的一些文献供大家参考（较早的情况可以参看综述文章）：8 z/ w) |9 i- l( R  E3 y

综述：% ~( Q* x' L. W3 g/ _6 ^% ?
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研究报告：
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(线虫体内直接转分化的最新文章尚没有找到，具体信息参看一位网友的寻求帮助帖：http://www.stemcell8.cn/thread-35793-1-2.html
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（个人粗浅体会，仅供本站网友参考，请勿转贴）

作者: tpwang 时间: 2011-3-12 16:24

回复 tpwang 的帖子: [* j9 V4 h& u* }9 l' @

绕过完全多潜能状态而利用部分多潜能状态的思路还有一篇新文章，采用“体外多潜能体内转分化”方法得到所谓induced conditional self-renewing progenitor (ICSP) cells。也可以看作是介于iPS和直接转分化之间的一个变种。
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详细情况可参看本站下贴：2 |# D5 l2 T& p
http://www.stemcell8.cn/thread-35668-1-2.html

作者: 大笨鸟 时间: 2011-3-15 19:57

谢谢分享

作者: tpwang 时间: 2011-3-15 20:38

本帖最后由 tpwang 于 2011-3-15 21:06 编辑 # ^- Z8 s. l( x% Q8 S1 t# b
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回复 tpwang 的帖子. \3 ]- N2 A" D- W/ `" z
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上贴提到的最新“体内直接转分化”文章，感谢vanallan网友帮助提供，附在下面（把该研究者先前的一篇相关先期研究整合在一个文件中，方便阅读）：
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研究者认为此研究的一个突出成果是发现体内直接转分化过程可以分为明确的阶段，并找到了限制体内直接转分化的机制及其在特定阶段的关键作用（图）：[attach]23076[/attach]% V2 G* a; Y, B# h m2 E, n% e2 W3 M2 Q
期待这个体内直接转分化机制在哺乳动物中得到验证。
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有趣的是俞俊英刚发表在PLoS ONE上的一篇小分子培养基iPS方法，也强调了一个特别的中间阶段（intermediate stage -piPSCs），这个阶段与特定的小分子有关。某种意义上，直接转分化和iPS都在试图解析重编程的过程或机制，界定重编程的阶段性及其关键因素是不约而同的思路。俞俊英也认为直接转分化是一个很有意思的途径，但她强调直接转分化的局限是无法提供足够数量和适用于广泛组织细胞种类的细胞供大通量药物筛选所用。虽然该研究结论说她们的Feeder-Free Episomal Reprogramming with Small Molecules方法有可能用于制造临床级的iPSCs，但该公司认为目前的主要用途是提供给大制药公司各种大批量无基因整合的iPS细胞供药物筛选等用途。这好像也是目前iPS的“热点”，NEJM和Nature三篇关于Long QT综合症的iPS疾病模型是一个证明。但要说特定疾病的体外细胞疾病模型，理论上直接转分化可能也有其优势，可以期待不久会有这方面的结果出现。

俞俊英文章：[attach]23078[/attach]- F- D0 b( ^- {( K/ G7 n# T" c

作者: evial 时间: 2011-3-15 21:52

真是好东西呀！顶一个

作者: evial 时间: 2011-3-15 21:53

真是好东西呀！顶一个

作者: nkqloveme 时间: 2011-3-16 14:34

顶一个！！！

作者: apengforever 时间: 2011-3-17 10:16

好东西

作者: 风口浪尖 时间: 2011-3-19 20:13

非常非常非常非常非常非常非常非常非常非常非常非常非常非常，感谢！

作者: sunshy2772 时间: 2011-4-6 11:00

不胜感激！谢谢分享~

作者: dabai22222 时间: 2011-4-19 01:52

最近在研究转分化，很有意思•

作者: snokey 时间: 2011-4-19 06:46

好文。不论实际应用还是发文章的角度，定向分化和直接转分化都是未来的热点。

作者: 漫步云端0511 时间: 2012-1-9 14:03

拜读

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