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标题: 细胞污染了的可能原因 [打印本页]

作者: luoye1986 时间: 2011-4-5 16:06 标题: 细胞污染了的可能原因

在实验室培养的细胞被污染了，应该是细菌污染，但现在找不到是什么原因？（是在二氧化碳培养箱中培养的），请大伙给出出主意

作者: elven_35 时间: 2011-4-5 16:40

细胞污染很常见，最好对实验室进行消毒，比如臭氧、新洁尔灭，实验操作使用的吸管等也需再高压。

作者: sdwzg119 时间: 2011-4-5 17:02

每一次发生污染你都要高标准的消毒，即使是你没弄清楚污染是在哪里发生的。

作者: ljzmy82 时间: 2011-4-5 18:06

抓紧时间消毒！

作者: sun_happone 时间: 2011-4-5 19:52

也有可能是交叉污染吧

作者: Temin 时间: 2011-4-5 20:48

培养基、胰酶、吸液枪头全部换过一套新的一般就好了。

作者: lanxiubala 时间: 2011-4-5 22:58

可以逐个排除，把你所用的培养基，PBS等都检菌，如果这些没问题的话，最大的可能是培养箱被污染了，像细胞房人随便进进出出，所谓的更衣间缓冲间没起到一点作用，细胞房也不经常用紫外杀菌，培养箱就很容易污染。还有可能就是你的操作不规范，操作的时候将细菌带到枪头上，移液枪上或者培养瓶里。还有一种可能，你复苏时候的细胞本身就带菌，越养菌越多。

其实你将培养基，PBS检菌没问题后，可以将培养箱消毒，一般培养过程中操作不规范容易染菌。当然，也可能是细胞种本身就有菌，你可以复苏一株和上次同一批冻存的细胞检菌试试。
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如果染菌以后，细胞状态还不错，基本上没受影响，你可以在消化和换液的时候用PBS或加过双抗的PBS多清洗几次，细胞可能会变少。再加上培养基中的双抗的作用，细菌不会大量生长，不影响你做实验就好啦。

作者: mbpsky 时间: 2011-4-6 08:46

细胞培养常见问题及其解决.rar & K4 Z& R+ B, f5 t% `4 |+ J

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http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=MjQ0NjV8NjFmYTZkMGN8MTc5Mzc1NTIwN3ww

作者: 王乾 时间: 2011-4-6 11:45

一、    实验室环境的原因3 x9 O1 s1 A5 P' Q

普通实验室由于洁净程度不高，粉尘相对较多，微生物极易充斥到空气中，
进而在培养箱与超净工作台之间传递细胞时，附着于细胞培养瓶皿上，再经过其他途径污染细胞。 - f. \% i/ m9 ?6 x/ A

   实验室中无法做到完全无菌，只能通过清洁卫生与消毒措施来尽量减少杂菌的滋生数量。打扫卫生时要注意不留卫生死角，清洁彻底。擦拭地板、台面等，要用配制好的消毒液，常见的有新洁尔灭（又称苯扎溴铵，使用浓度0.1%）等。实验室消毒常用紫外灯，简单方便。另外醋酸熏蒸也很有效果，但是对金属设备有缓慢的腐蚀作用，应低频率应用。臭氧、戊二醛等杀菌方式常用于洁净车间的消毒，对人体机能有所损害，使用时应注意安全。实验室中要保持空气干燥，广东天气多潮湿，应定期除湿。最好有通风系统，让空气流通不浑浊。室温不宜过高，最好保持在30℃以下。
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二、    试剂溶液的原因

动物细胞培养的试剂溶液主要有培养基、PBS、胰酶消化液。由于PBS为高
压灭菌，胰酶用量少，较容易控制污染，只需在操作时注意即可。而培养基用量大，本身营养丰富，适合很多微生物生长，采取的又是过滤式除菌，是无菌防控的重点。, Y( f9 {" q, ~1 o) X
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过滤通常有滤芯与滤膜两种功率介质。滤芯价格较贵，但能承受较大压力，一次性可过滤大量体积液体，可以循环使用。滤膜价格低廉，为一次性耗材，承压力较小，过滤速度慢于滤芯，一般是0.45um和0.22um孔径的两张滤膜配合使用，在过滤过程中容易破裂。技术中心（研究院）目前采用的是滤膜过滤方式，由蠕动泵提供压力。在培养基制备过程中，应注意：1培养基粉末应完全溶解，否则易堵塞滤膜，致使压力过大而使滤膜破裂；2蠕动泵转速要适度，避免产生过大压力；3过滤后亲自拆开滤器，观察滤膜是否完好。建议在过滤过程中取样20~40ml装入培养瓶，放入37℃培养箱中培养一周，镜检无异常后再使用，可保证安全性。
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三、    器皿的原因
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主要包括蓝盖瓶、移液管、废液缸、滴管、培养瓶等玻璃器皿，均为可高压# P8 u" S: \) p, O
物品，在开瓶盖或使用时注意用火焰灼烧一遍。无菌操作时注意瓶口不要残留液体，如有残留，及时用酒精棉球擦拭。技术中心有的实验室采用的是一次性培养瓶，效果好，安全性高，但成本也较高。' M0 z6 u  E, R1 A

四、    设备的原因: N! L" K5 S4 s' y( N+ k; T
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主要包括超净工作台、二氧化碳培养箱、水浴锅、电动移液枪等。% q+ w0 O  }& U

1、超净工作台：是我们进行无菌操作的基础和保障。按无菌风的流向可分为从上向下的垂直风类型和从里向外的水平风类型。目前我部门使用的均为单面垂直风类型超净台。超净台通过顶层的高效空气过滤器提供无菌风，保证内部的无菌环境。使用超净台应注意：1）高效滤器正常使用寿命通常为一年到一年半，应定期更换。2）每月定期进行超净台的无菌检测，大致方法为：紫外杀菌后，台面上放置4到5个琼脂平板，风机开动30分钟，然后培养1至2天，观察平板染菌情况；3）避免上风操作：操作中，手或物品尽量避免出现在开盖溶液的上方，以防止无菌风将杂菌或尘粒吹入溶液中；4）清洁卫生：平时我们最注重的是清洁台面，却容易忽略其他卫生死角。紫外灯管和日光灯管处于超净台上方，无菌风会将附着其上的灰尘、杂菌吹下；大多数超净台中的酒精灯表面都是脏的，多为培养基和灰尘的混合物，是超净台内的最大污染源，却最易被人忽视。, v1 U% P/ d! _; G

2、二氧化碳培养箱：为细胞生长提供良好的内环境。需要注意：1）定期更换高效滤器；2）发生染菌后要对内部进行彻底消毒，隔板最好用酒精灼烧或高压灭菌；3）下部的盛水器中最好加入双抗。

3、水浴锅：处在开放式环境下，温度一般设定在37℃，极易有杂菌在水中滋生，附着在溶液瓶表面带入超净台内。要经常更换蒸馏水，定期将水温调至高温进行杀菌。9 S% H8 n. v" O1 f& A2 i* }5 Z1 t

4、电动移液枪：内部结构是外胶管、0.22um空气过滤器、微型电动机。外胶管是移液器和移液管衔接的部位，应时常用75%酒精擦拭。移液操作时要特别注意防止液体倒吸，一旦发生应立即用酒精擦拭外胶管，更换空气滤器，才能再次使用移液器。进液的空气滤器用清水清洗过后，放入干燥箱内烘干，经检验合格后重复使用。, F; {, X0 T: I
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作者: dqm185 时间: 2011-4-8 04:23

根据我个人经验，如果是突然发生，主要由于操作不慎。注意取放细胞时候用酒精先消毒手套，不要朝培养箱呼气，尽量减少开关培养箱的次数和程度；在操作台操作时，注意无菌操作，不要长时间敞开盖子，在敞开盖子时候不要让任何东西经过其上方；发现污染后，全面清洗培养箱每个角落。值得注意的是，要全面清洗操作台，并将台面揭开来清洗下层；我们操作台的下层估计有几年没人清洗过...不知道你们的情况怎么样

作者: Pseudomonas 时间: 2011-4-8 08:14

假定你的无菌操作什么都是过关的--我们以前出现类似的问题，后来发现超净工作台没有问题（进行了消毒以后还是有同样问题出现），主要还是培养箱里出现了污染。把培养箱彻底清洗（能够高压灭菌的部件进行高压灭菌）后问题就解决了。培养箱里增加湿度的水槽里要加铜防止长菌！

作者: cheese 时间: 2011-4-11 20:05

如果突然出现一次细胞污染，操作不当的可能性最大，尽量做到无菌操作

作者: sophie 时间: 2011-4-24 14:32

回复 mbpsky 的帖子
" v6 ?: i. \& u$ E4 l+ T5 i _3 v
为什么不能下载嘞？

作者: 细胞海洋 时间: 2011-4-24 18:56

回复 sophie 的帖子2 K* q A4 w9 p( Z5 S* w3 ^
1 `/ D" Z+ i$ U' r+ z
可以下载不要使用迅雷

作者: zzutopia 时间: 2011-9-14 15:40

哎，我的今天也有三皿污染了，太郁闷了……

作者: xiaoxiaozone 时间: 2011-9-14 16:01

注意个人操作，另外试剂都换新的

作者: azzyou 时间: 2011-9-22 11:06

移液枪倒吸会不会引起大规模的污染的啊？

作者: 王乾 时间: 2011-9-23 10:46

你可以一一排除，首先你的培养基有没有污染，即把培养基放入一个小皿里，不放细胞，37度检菌，如果有污染，就在把培养基的每种成分检测一遍。
其次，看是不是其他同学也有类似的现象，如果有的话，那说明是公共仪器或试剂的污染。

作者: ldy689689 时间: 2011-10-23 19:38

可能是实验人员的操作不规范所导致，同时也有可能是实验室有污染源，或者是工作台灭菌不彻底，再者就是你所加的培养液或因子遭到了污染，当然培养箱的卫生和实验室的卫生需要进行清查也是有可能的，你就一个一个的进行处理吧。

作者: liuyul03 时间: 2011-10-24 08:19

原代培养污染往往是样品没处理好而带进来的污染；原代样品处理，个人认为70%酒精浸泡这个步骤很关键，尽管很多文章上面不会写。传代污染则主要是细节没做好，尤其是同一批次的，有的污染了，有得没有污染。

作者: azzyou 时间: 2011-10-26 09:27

原因可能要一步一步排查，如果操作没问题就检测下超净工作台和移液管是否污染，没有的话估计就是培养箱的问题了。

作者: azzyou 时间: 2011-10-26 09:30

发现是培养箱污染，马上撤出所有细胞，彻底打扫培养箱各个角落，隔板最好拿出来高压灭菌。

作者: zhusealin 时间: 2011-10-26 09:53

不要和别人共用培养基

作者: 举锅 时间: 2011-10-26 13:37

培养箱保湿水要每周换一次，培养箱每个月要清洁，包括里面的各个部件要卸下来消毒，并照紫外。从培养箱中拿东西或者放东西时养成先对手部消毒的好习惯。实验室应常用新洁尔灭清洁，并紫外灭菌。随时保持实验室温度和湿度等

作者: bjman10016 时间: 2011-10-27 07:51

除以上各位的意见外，有些二氧化碳源不行，可以在其到培养箱的通路上加过滤装置。

作者: dandan9230 时间: 2011-10-27 10:27

1试剂要高温消毒，要么就过滤除菌。% L# z, V/ {2 T( r; z6 d
2耗材高温灭菌
3环境要定期消毒，臭氧，甲醛等定期熏蒸 d4 L: s1 c& _' ^
4设备要定期擦拭，安全柜的过滤器要换，紫外灯要换。
5人员更洁净衣，洗手消毒。不能讲话，咳嗽等等。大多数都是人为污染

作者: deshenglll 时间: 2011-11-23 15:45

还有人员的操作很重要啊。有些样本很少。要珍惜啊。

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