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标题: 小鼠骨髓间充质干细胞 [打印本页]

作者: bianhuimou 时间: 2011-4-8 21:03 标题: 小鼠骨髓间充质干细胞

我养小鼠间充质干细胞已经大半年了，可是养的还是不好。细胞传代后容易老化，形态变化较大，请高人指点下。而且我应用普通培养基根本养不出小鼠BMMSC,大家帮帮忙吧

作者: iceyang 时间: 2011-4-8 21:34

小鼠BMSC的确很难养，使用特殊的培养液另外在低氧培养的条件下可能会有不错的效果。

作者: pei 时间: 2011-4-8 22:51

用低糖DMEM就可以养得很好了

作者: clairezy1983 时间: 2011-4-8 23:20

我养小鼠骨髓干细胞有一段时间了，建议用骨片法，建议用STEMCELL公司专门的培养基，小鼠的MSC形态就是不像人的那么好，我把我自己整理的实验方法发给你，希望能给你参考。
原代MSC培养
1. 断髓法安乐死处死老鼠（4-5周龄，雄性BALB/c鼠），在酒精中消毒5分钟，无菌取出后腿，去除韧带和多余的组织，从踝关节和髋关节处分离出股骨和胫骨，置于加双抗的D-hanks液中。
2. 用剪刀和镊子彻底地去除肌肉，切除骺端。确保骨头上无附着肌肉。
3. 将骨头放置在10ml缓冲液中，Buffer: PBS+2%FBS+1mM EDTA。
4. 用注射器尾部圆饼摁压骨头，力度要轻，使骨头裂开即可，轻微搅拌使骨髓从骨片中释出，用移液管吸出缓冲液。. u; A/ P+ B# Y& t& C9 K
5. 加10ml新鲜缓冲液重新搅拌洗涤，去除骨髓，重复5次，直至骨头洗白，大部分骨髓被除去。3 _* n. F& C& L4 L% k' G
6. 去除缓冲液，加入2ml 胶原酶I溶液（0.25% 胶原酶I + 20% FBS + PBS），预消化3-5分钟，使骨髓软化，容易切碎。
7. 用剪刀剪碎至1-2mm，以保证释放足够细胞量。
8. 将碎屑放入50ml离心管中，加入胶原酶I溶液至总体积10ml, 或者2ml/鼠，加封口膜，将离心管放置在37℃摇床恒温槽中最大速度消化45分钟。摇床的速度设置为200rpm。
9. 加入缓冲液到总体积30ml，1200rpm，室温离心10分钟，制动打开。用MSC培养基将细胞重悬浮，接种于T75，骨片也一同接种于培养瓶中，让其均匀铺开。置于孵箱孵育。 _7 U! X }) ]/ a+ b w

作者: sping 时间: 2011-4-8 23:48

10%FBS in DMEM/F12也可以养得很好。低糖培养基也可以养得很好。MSC培养条件不成熟，传代不宜超过10代

作者: shqinzhu 时间: 2011-4-8 23:52

谢谢LZ

作者: bianhuimou 时间: 2011-4-10 14:58

我也用的是STEM CELL的培养基，骨片法也试过，也很注意细节，可是细胞还是养不好

作者: bianhuimou 时间: 2011-4-10 14:59

低糖DMEM+10%FBS也试过，也养不出来，细胞很杂，不易纯化，而且细胞很易分化

作者: bianhuimou 时间: 2011-4-10 15:00

有养出小鼠MSC的朋友把细节说说吧，实验进行不下去了，感谢大家帮忙

作者: zxdlala 时间: 2011-4-11 16:49

回复 sping 的帖子, S: |- U) e/ p+ J) N

你好SPING，我也用的F12，全骨髓贴壁法，但是36小时首次换液后细胞还是圆的，怀疑是没贴壁，不知道怎么回事，你遇到过这种情况吗？

作者: 若兰汀 时间: 2011-4-15 10:32

小鼠骨髓间充质干细胞培养需要额外添加细胞因子，可防止老化，stem cell 公司有售,具体名字我忘了，回去找找。

作者: zxdlala 时间: 2011-4-21 11:53

[attach]25640[/attach][attach]25641[/attach], q/ a% T! I4 R0 h* A {- ~& Z
第十天，细胞不太好了，一起养细胞的说是中间密度太高挤死了，我也不知道怎么回事，发上来大家看看吧

作者: zxdlala 时间: 2011-4-21 11:55

我觉得细胞长得还不太满，也把它传代了。还不知道活的怎么样，下午去看看，希望他能活的很好吧

作者: zxdlala 时间: 2011-4-21 11:56

基本上每个克隆里都有几片这样的暗区，可能就是该传代了吧

作者: honey.joanne 时间: 2011-4-21 14:06

可以用全骨髓贴壁法从小鼠骨髓分离培养出 MSC，在体外进行有效扩增；' Z% p6 R) I' m: o' V
MSC的传代培养：, [9 k8 Z+ j6 q5 c* A& E5 q
原代细胞生长达80%~90%时，吸净培养瓶中的液体， PBS洗涤 2次，取 37℃预热过的 0.25 %胰酶 3~4 mL，于 37℃恒温水箱内消化 1 min。镜下观察细胞见细胞从梭形变为圆形，以 10%胎牛血清的 DMEM培养基终止消化，吹打细胞，使细胞完全从培养瓶中脱落并吹打成单细胞悬液。吸取细胞悬液至 15 mL的离心管中， 1 000 r/min离心 5 min，移去上清，见离心管底部一层白色沉淀，加入 DMEM培养液，制成单细胞悬液。原代细胞按 1:2比例传代培养。传代后的细胞继续按原代培养的方法培养，直至下一代传代。共传代 3次

作者: alioli 时间: 2011-4-22 23:19

培养小鼠MSC，培养基很关键，stem cell公司有mouse mesenchymal stem cell 培养基出售，但是比较昂贵，三千多才500ml，而且成分保密，不知道是否添加了什么因子。如果用一般培养基的话，血清尽量选进口的胎牛血清，比如Gibco的，国产的效果不佳。2 }* O T% p ~$ g# I8 |) V6 S
另外，以我的经验，楼主上面的细胞还没有达到传代的标准，应该要等细胞形成较大集落并且集落间开始融合后才能传代，否则一是消化是很困难，很多细胞贴壁消化不下来；二是得到的细胞状态不好，生长迟缓。

作者: smilewpp 时间: 2011-4-26 16:33

我养的也是。。形态很多，有看到类似的间充质干细胞形态的，也有圆形的，怎么纯化的？6 c" C& v4 n% C3 U2 n

作者: open1230 时间: 2011-4-27 22:03

用3-4代的间充质干细胞，10代以上的话形态就不好了！

作者: bianhuimou 时间: 2011-6-23 20:30

哪位用的stem cell 公司的培养基并且应用骨片法养小鼠MSCs呀，能介绍下宝贵经验吗？我养了一年了，可是还是养不出来

作者: bianhuimou 时间: 2011-6-23 20:35

回复 clairezy1983 的帖子

您好，我也用该公司的小鼠MSC培养基采用骨片法养细胞可是，还是不理想，细胞老化形态改变很大，想请您介绍下你的心得，感谢！

作者: clairezy1983 时间: 2011-6-23 23:46

回复 bianhuimou 的帖子
% p+ e' r9 j# A$ k; `7 A
小鼠的MSC形态跟人的没法比，人的MSC形态比较规则，看起来挺整齐，小鼠的MSC样子挺丑的。我已经很长时间不养小鼠的MSC了，现在主要做人的。$ M( C; K2 |; w- V( ]6 x
你用骨片法的时候要把骨片一起种到培养瓶里，放入孵箱之前，摇晃均匀，最好三天都不要动它，可能要更长时间细胞才能长满，然后你会发现从骨片周围爬出很多比较整齐的MSC，有的时候呈放射状。你要是总是不同的观察，骨片就飘走了，不利于细胞的爬出。3 E! W5 d6 p, }# t
他们公司的protocal里面说的还要过滤，这一步也是省略的，因为要直接把骨片弄进去的嘛。
还有碾磨的时候一定要动作轻柔，垂直用力，而且要轻，只要把骨腔打开，让血液出来就好，千万不能左右摩擦。
碾磨之后冲洗的时候也得温柔点，我有一次就是冲洗过度，洗得很白净，但是干细胞也没有，那些红红的血水去掉就好了哈。7 J9 w4 \8 r5 I1 X" W% R! x
传代培养的时候密度最好大一点，还有不能消化过度，很多消化不下来的细胞根本就不是MSC哈。据我的经验，MSC很好消化。' Y% s1 z/ ?# Y/ B9 O
暂时就想到了这么些，希望对你有所帮助。

作者: liuxiao2006 时间: 2011-6-24 11:05

我用的是DMEM/F12的培养基加上进口胎牛血清（10%），细胞长势很好啊。可能与细胞株有关吧，我用的是纯化过的细胞株，大概3天就要传一代

作者: bianhuimou 时间: 2011-6-26 12:59

回复 clairezy1983 的帖子
& c* r3 J) y O# R
是的，骨片法原代法可以看到放射状爬出的MSCs,可是传代后细胞形态变化的很丑，乱糟糟的。

作者: clairezy1983 时间: 2011-6-26 14:52

回复 bianhuimou 的帖子" O5 Q" A% S) i# ]" V

恩，你试着降低胰酶浓度，和消化时间，不要期望把所有细胞都吹下来，很多细胞消化不下来的都不是MSC哦。

作者: bianhuimou 时间: 2011-6-26 20:17

恩，胰酶浓度0.25%，消化两分钟，我之前养出来一瓶可是之后就再也养不出来了。

作者: clairezy1983 时间: 2011-6-27 10:43

回复 bianhuimou 的帖子7 B/ \" J: s0 z
+ w# A+ F# V# x& B
浓度有点大，降，大胆的降哈

作者: bianhuimou 时间: 2011-6-28 10:28

回复 clairezy1983 的帖子! ~ I. h6 |* O/ P+ p" D1 q7 m

大胆的降！哦，我试试，这个细胞太难养了

作者: bianhuimou 时间: 2011-6-28 10:29

回复 clairezy1983 的帖子

我最近进行诱导分化可是总是不成功，您有经验传授一下吗？

作者: clairezy1983 时间: 2011-6-28 17:47

回复 bianhuimou 的帖子

我现在都是做人的脂肪来源的MSC，没有做鼠的呢。我是做成脂成骨诱导。

作者: viv2005 时间: 2011-6-29 08:02

我做rat的，小鼠的没做过，不知道我的protocol有参考价值没，感觉MSC是最好培养的了，比什么osteoblast和osteoclast好养多了
' g9 O, b! r1 Z& _8 K9 u: L
MSC  Isolation from Rat Femur and Tibia, {2 g8 u1 ^( u+ s  `$ ~$ V, l9 `
1. Euthanize the rats with CO2 for 5 mins.$ H. h  G7 F0 @: {; b& q) @
2. Isolate femur and tibia by disconnecting them at the joints.
3. Clean the bones of soft tissues.
4. Wash both femur and tibia in PBS containing 1% penicillin/streptomycin twice.8 ^7 t( }/ G$ L" r+ C# s3 p+ G
5. Under the cell culture hood, clip-off the epiphyseal plates to expose the bone marrow.
6. Using a syringe, flush the bone marrow with 10 ml of media into a dish.
7. Break up the clumps by aspirating the cell solution multiple times.
8. Using a 70μm cell strainer, filter the cell solution into 15ml tube. This will remove any unwanted debris and bone fragments.# z  O1 {( a2 a6 c' x6 X5 A
9. Centrifuge the filtered cell solution at 1000rpm for 10 min.1 N% M4 @" j6 S) e0 x8 l" i. C9 v
10. Resuspend the pellet and pipet this solution into a 100mm dish.
11. Incubate for the next 48h.
12. Change media to remove non-adhering cells.! [" J# A- r& U% m
13. Change media every 2-3 days, even the media doesn’t change the color., D" K6 u$ {" S! G% r& r9 [
14. Usually the cell will be confluence at 7-10 days, and then are ready for passaging.3 A8 F& B' [* S

作者: 皮搋子 时间: 2011-7-2 15:40

请问骨片法培养的是间充质干细胞吗？

作者: bianhuimou 时间: 2011-8-16 11:39

回复 sping 的帖子4 K4 e3 N- B& Z" Z" X# L6 |6 e
8 N/ h) ]9 ~: e2 [8 o
您养过小鼠MSC?我用stem cell 的培养基都养不出来，请您指点一下！

作者: 细胞海洋 时间: 2011-8-16 21:43

回复 bianhuimou 的帖子5 T3 {$ C& R. K0 S( z( X( j8 i6 W. S
- _* e3 I7 k7 d5 x( a" L
建议你详细说明你的问题发新帖提问

作者: xiaoyurly 时间: 2011-9-22 16:42

如大家所言，小鼠MSC确实很难养出来，对血清要求高、纯化难且容易老化。7 O; X. u6 ]* f$ ^2 E- i2 Y# O* S
我用4-5周龄的C57小鼠培养，2只小鼠的全骨髓放1个10cm盘，用20%FBS+αMEM培养基。3天时换全液，此后每2天换液，5天时即可看到有克隆长出，一般7天时可传代。传代时胰酶消化时间要严格把握，随着传代杂细胞（主要是CD45+ HSC）会逐渐去除。到5代时MSC比较纯可用于后续实验（如分化、移植等）。

分离骨髓时用无菌纱布剥离肌肉，放在研钵里轻轻用力将骨头研碎，这样比较省时省力。- n4 q) X( [, `3 c. K, @
ps. 曾经养过balb/c小鼠的MSC，私以为比C57的难培养一些。

作者: bianhuimou 时间: 2011-9-24 20:36

回复 xiaoyurly 的帖子2 q1 H+ z* U6 h0 f( q1 o& |2 d

您好，请问您用的培养基和血清的货号能提供吗？

作者: bianhuimou 时间: 2011-9-24 20:38

回复 xiaoyurly 的帖子 }7 S9 j& {4 z% m

我用买的stem cell 的培养基都没有养成功，感觉细胞很容易分化，不知您是否能提供你的培养基和血清的货号？我想试着再养养

作者: bathpp2007 时间: 2011-11-15 20:30

liuxiao2006 发表于 2011-6-24 11:05
+ q* q3 X5 I: @9 v% J我用的是DMEM/F12的培养基加上进口胎牛血清（10%），细胞长势很好啊。可能与细胞株有关吧，我用的是纯化过的 ...

是小鼠的吗? 如何纯化的呢？
请指点

作者: asejon 时间: 2012-2-8 11:16

本帖最后由 asejon 于 2012-2-8 11:45 编辑 1 o4 m+ e% ^1 u+ E+ E

回复 clairezy1983 的帖子

以前还真不知道可以用胶原酶I溶液消化骨片提取间充质细胞，见识了，但是不是会混入骨细胞呢？会不会诱导干细胞成骨分化呢？

作者: clairezy1983 时间: 2012-2-16 10:23

回复 asejon 的帖子/ L% C! u; s4 I
4 H3 K; q- G% r! b$ v. W' v
不会，培养基没有适合成骨分化的条件啊，骨细胞更不会吧，我觉得那些干细胞应该是从骨膜上爬出来的

作者: asejon 时间: 2012-2-17 21:05

成骨细胞也会从骨片中爬出，这是获取成骨细胞的方法，如果成骨细胞跟间充质干细胞一起培养，成骨细胞必然会分泌物质而调节干细胞向成骨方向分化

作者: 644414915 时间: 2013-1-8 14:08

回复 iceyang 的帖子

这个方法你试过吗，这是很多公司推荐的

作者: 644414915 时间: 2013-1-8 14:09

回复 bianhuimou 的帖子

兄弟后来bmsc养出来了没

作者: 644414915 时间: 2013-1-8 14:10

回复 clairezy1983 的帖子3 t- C3 [3 k' `
; M. a/ R4 t) E* t! n% w, f8 J
你好，能发张你养的小鼠msc图片看看吗

作者: 644414915 时间: 2013-2-2 21:36

回复 pei 的帖子# y* \* C& ^! m0 S- E4 c5 _

你好，你有养出来的小鼠骨髓间充质干细胞图片吗

作者: 644414915 时间: 2013-2-2 21:38

回复 clairezy1983 的帖子

你好，你有用这个方法培养出来的细胞传代如何，有图片吗

作者: redmoon610 时间: 2013-2-16 18:49

本帖最后由 redmoon610 于 2013-2-16 18:53 编辑

小鼠BMMSCs注定量是不足的，要想养好需要很大功夫，我一般都是4只小鼠16条腿才养够原代，而且要用ACK进行去血细胞，最多用到第5-6代，之后的就老的不能用了。等等发一张第3代的，梭状细胞，漩涡生长。

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