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标题: RNA抽提测OD值原理 [打印本页]

作者: asiar 时间: 2011-4-15 09:13 标题: RNA抽提测OD值原理

请问RNA抽提时测OD 的原理到底怎样？DNA 、蛋白污染时会怎样？为什么？

作者: pei 时间: 2011-4-15 09:43

蛋白质的最大吸收峰在280nm处，而核酸的最大吸收峰在260nm处，若有蛋白污染，则OD280会比较大，相应的OD260/280会比较小

作者: asiar 时间: 2011-4-15 10:03

回复 pei 的帖子 @$ Y5 S7 N( u. L: I5 @- h
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那为什么有RNA 降解时OD260/280会偏大？

作者: dqm185 时间: 2011-4-15 10:19

本帖最后由 dqm185 于 2011-4-15 10:22 编辑
O; _0 w' ]1 G5 ?# \, i! k4 ~
主要的楼上的已经回答的不错了。我再补充点细节。
核苷酸和核酸在紫外光区具有特征性的吸收光谱是由于其嘌呤碱或嘧啶碱具有共轭双键，最大吸收峰在26Onm。紫外分光光度法测定核酸的浓度时，1个吸光度值(lA)相当于50μg/ml双螺旋DNA；401μg/ml单螺旋DNA或RNA；20μg/ml寡核苷酸。
对于蛋白质，其中也存在着含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，使蛋白质在270~290nm波长范围内具有吸收紫外光的性质,其中酪氨酸的λmax为275nm，色氨酸的λmax为280nm，苯丙氨酸的λmax为257nm，在此波长范围内,蛋白质溶液的吸收值与其浓度成正比,可作定量测定。但是，值得注意的是不同类型蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量不同，所以测定270~290nm波段紫外吸收也会因每个样品中蛋白质氨基酸组成的差异而有较大的变异。" h4 T! w8 {! \/ g- ~* I
纯DNA样品的OD260/OD280 大约为1.8，高于1.8可能有RNA污染，低于1.8有蛋白质污染；纯RNA 样品的OD260/OD280 大约为2.0.
更多细节参考：http://jpkc.hnadl.cn/Able.ACC2.W ... amp;type=&name=
http://www.biotechworld.cn/news/display/article/9027. d) a$ @& r+ d

作者: dqm185 时间: 2011-4-15 10:47

本帖最后由 dqm185 于 2011-4-15 10:48 编辑
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回复 asiar 的帖子$ K# I7 ~7 c) F0 P
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RNA降解是个好问题，找了半天暂时没找到标准答案。但是，DNA变性时，DNA双链发生解离，共轭双键更充分暴露，故DNA变性，DNA在260nm处的吸收光度值增加，并与解链程度有一定的比例关系。2 v$ ^" ~ R! B2 c' P1 H m
所以对于RNA降解导致OD比值变化，个人认为，还是应该从其吸光原理和RNA的可能的三维结构考虑。虽然RNA理论上是单股链，但是其中可能有序列是互补的而产生局部双链情况，遮盖部分共轭双键，当RNA降解时，可能使三维结构破坏而导致共轭双键暴露更充分，吸光值增加。& @/ l3 ^ W' S ], l- Z% k l9 U

参考：http://zhidao.baidu.com/question/6886513. g' J. S7 A& M/ m# {* v# o( D4 `
http://www.fruit8.com/?action-blogdetail-uid-15355-id-3216
http://nt.xhbxx.com/html/news/819.html

作者: hcluo 时间: 2011-4-15 11:16

关于RNA质量问题，因素很多。我们实验室会做两个方面的工作，首先测定OD值，然后琼脂糖检测带型。来确定RNA提取的浓度和纯度。小片段增多，表示存在降解。

作者: asiar 时间: 2011-4-15 13:04

回复 dqm185 的帖子
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非常感谢！就是找的这个原理，学过，可是忘了

作者: asiar 时间: 2011-4-15 13:06

回复 dqm185 的帖子
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解释的很好，终于明白了，谢谢~

作者: Pseudomonas 时间: 2011-4-16 01:04

RNA和DNA或蛋白的吸收谱不同，我们实验室用的是NanoDrop，不仅要注意OD260/OD280（楼上的也说了），而且要看整个吸收峰的形状，就会了解RNA的纯度了。OD260/OD280有DNA污染的时候数值变化较小，有时候很难判断。9 `# u: c6 G# }1 @) t8 ]

当然吸收峰也不能看出RNA是否降解成小片段，楼上说的琼脂糖电泳检测带型对检测降解非常关键。
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多做几个样品，有经验了一眼就可以看出样品的质量了。

作者: 王乾 时间: 2011-4-19 13:45

A260 /A280 比值低 : [) v' p% U/ O2 ]9 h k) R
蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机项。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要使劲混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。解决办法是用 PCI 重新抽提一次，再沉淀，溶解。 1 Z) t7 S. J. j
苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机项。加入氯仿后首先要使劲混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。解决办法是再沉淀一次后，溶解。
设备限制：测定 A260 及 A280 数值时，要使 A260 读数在 0.10 - 0.50 之间。此范围线性最好。
用水稀释样品：测 OD 时，对照及样品稀释液请使用 10 mM Tris，pH 7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。
　
A260 /A230 比值低
抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75% 乙醇。解决办法是再沉淀一次后，溶解。 * T( {) J! `1 S! J/ {6 p4 Q
组织内杂质残留：一般为多糖类杂质。解决办法是改用其它办法，如 LiCl 沉淀。 3 X. d2 e' `! S. y7 n. ?4 L
设备限制：测定 A260 及 A280 数值时，要使 A260 读数在 0.10 - 0.50 之间。此范围线性最好。

作者: lh_kitty 时间: 2011-4-19 14:28

我们实验室也是用的nanodrop，感觉比吸光度法要灵敏。RNA降解程度比值还是不准，还是要跑电泳鉴定吧

作者: meilin0118 时间: 2011-5-29 15:54

讲的太细致了！

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