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标题: 求胶原酶Ⅰ的配方？？ [打印本页]
作者: zerollx    时间: 2011-4-23 16:57     标题: 求胶原酶Ⅰ的配方？？

    大家在分离脂肪干细胞时的胶原酶是怎么配的啊？有的直接用DPBS溶解，有的添加适量的BSA，也有的用无血清培养基配，大家都是怎么做的，跪求详细步骤...
作者: baiyunrui    时间: 2011-4-23 20:20

用血清培养基配要好点吧！我是那样做的！好像那样能更好保持其活性！
作者: zhuanzhuan    时间: 2011-4-23 21:08

I型胶原酶，常用的是用培养基配和血清配的，先用培养基溶解，过滤后再按照体积加入一定比例的血清，一般是20%的血清，然后分装，-20°保存，用之前融化。一般不反复冻融。
作者: zerollx    时间: 2011-4-24 09:09

本帖最后由 zerollx 于 2011-4-24 09:23 编辑
4 B. l& I2 C: {0 ^* A8 u$ D5 R! V$ N0 y% w$ e- b) C* C  X6 J
回复 baiyunrui 的帖子+ J; m6 n. G7 I. ?! K

, c* R' Q* V' L( y9 X& Z9 y! `血清不会像胰酶一样影响胶原酶的活性么？DMEM用的是高糖的还是DMEM/F12？
作者: zerollx    时间: 2011-4-24 09:09

本帖最后由 zerollx 于 2011-4-24 09:23 编辑
9 F) P7 L$ s! ?/ O9 J9 q- B2 e9 R/ K2 [0 z' Z/ @+ Q" \) D- E5 N' p  \
回复 zhuanzhuan 的帖子1 t4 U7 n1 i, C- g/ q1 p

6 M3 H5 \. k3 N% z: {- m血清不会像胰酶一样影响胶原酶的活性么？DMEM用的是高糖的还是DMEM/F12？
作者: 临床干细胞    时间: 2011-4-24 09:33

zerollx 发表于 2011-4-24 09:09 ) R9 H) |7 e7 v
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9 z3 H7 K- x0 T6 ~4 k/ t$ H' ?+ |7 w( H2 g
血清不会像胰酶一样影响胶原酶的活性么？DMEM用的是高糖的还是DMEM/F12？

: c7 w9 @# [, S, F$ ]5 t+ s$ W养干细胞一般不用高糖
作者: zerollx    时间: 2011-4-24 11:14

回复 临床干细胞 的帖子7 ~) [3 H8 ~1 P& ^% D4 |- ~2 {) E
! ^, M: V5 q7 J; B
嗯，我在后期培养中用的是DMEM/F12，是低糖的，我想知道的是在胶原酶消化的时候用于配制胶原酶的培养基是高糖的还是低糖的？
作者: 牙牙丫丫123    时间: 2011-4-24 13:25

回复 zerollx 的帖子: q# x9 [- l4 }2 B! x8 I" R/ c
3 C% }; H+ s1 y1 M' X8 g
一般是用无血清的培养基好一点，直接配置你所需要的浓度，然后用DMEM溶解
作者: 牙牙丫丫123    时间: 2011-4-24 13:30

一般是用无血清的培养基好一点，直接配置你所需要的浓度，然后用DMEM溶解
作者: zhuanzhuan    时间: 2011-4-24 18:28

我们用IMDM，有时候也用PBS，主要看你是什么细胞哦。胶原酶在原则上不能被中和，只能稀释。血清补影响胶原酶的活性！
作者: baiyunrui    时间: 2011-4-26 17:30

写错了不好意思( e) n1 g4 B& A; e
我用是的过滤好的低糖的DMEM，没有加任何东西！
作者: hehe100    时间: 2011-4-27 09:47

  0.2% I型胶原酶的配制（使用浓度0.1%）+ p  _4 \0 q9 D0 \! P
1准备：预热的Alphar-MEM培养基、250 ml蓝盖瓶、滤器、20 ml注射器
+ G5 W7 p; \$ ?; m- M2过程：首先称取200 mg胶原酶粉末放到称量纸上，注意要带口罩，然后拿进细胞房，将粉末加到蓝盖瓶中，再加入100 ml预热的培养基，混匀。
; L7 ]/ o* ?/ ?5 W. W         然后用注射器吸取溶液后用过滤器过滤到50 ml离心管中，用封口膜封好后贴上标签放到-20度，现用现拿。* p" E. h6 I& R" W
这个是我们医院的配方。
作者: 翅膀111    时间: 2011-6-3 17:37

据说血清对胶原酶I没什么影响，但很多论文说法是血清中和胶原酶，然后离心去上清液，但也有人说血清对胶原酶没中和作用。所以我的做法是胶原酶消化后直接离心的。我开始用PBS配制，也能消化脂肪得到干细胞，但是感觉比用DMEM配制的效果差很多。可能基础培养基对细胞的保护作用比PBS效果好。
作者: xiaoming210    时间: 2011-10-21 05:09

最好是用无血清的培养基配置胶原酶，只要注意消化时间就不会对细胞活性有大的影响
作者: 天枰2012    时间: 2011-11-9 23:04

可以直接用低糖DMEM溶解配制
作者: 晓哥    时间: 2012-3-6 21:55

我都是用PBS来溶解胶原酶的，用起来没有问题。关键是要足量，否则消化能力会减少很多。
作者: yxp    时间: 2012-4-1 10:13

我们实验室用的是无血清的DMEM溶解胶原酶，浓度时0.075%，而后过0.22μm的滤膜灭菌，就可使用了
作者: B1228    时间: 2012-4-1 10:38

胶原酶I 配出来是 咖啡色的么？
作者: 相宜    时间: 2012-4-6 00:16

回复 牙牙丫丫123 的帖子7 l) \1 }7 t# {! L# {
8 n2 P. `- T% `4 T
我想配0.1%浓度的I型胶原酶，要是10ml培养基应该放多少mg的I型胶原酶粉剂呢？
作者: 牙牙丫丫123    时间: 2012-4-6 21:56

回复 相宜 的帖子9 p+ P: u8 m: _1 E5 Y3 w. x
6 W/ F* h2 A+ ]; J
原则上是1ml等于1g，你要配0.1%的胶原酶10ml，也就是需要加10mg的胶原酶粉末
作者: 相宜    时间: 2012-4-7 00:12

回复 牙牙丫丫123 的帖子8 T* v) X) z# Z8 {( m% z/ D" J
! ]) A% K5 W- e
那我准备消化5ml的脂肪需要加多少ml配制好的胶原酶溶液呢？消化的时候是恒温振荡还是静置在培养箱消化呢？请大侠指教！
作者: 相宜    时间: 2012-4-26 10:43

那么3ml的纯脂肪颗粒一般用多少的0.1%浓度的I型胶原酶消化呢？
作者: danieldan08    时间: 2012-5-29 22:32

回复 相宜 的帖子
) W5 f* y* \: `& B
7 y5 n" S  `& x% K- I  X那我准备消化5ml的脂肪需要加多少ml配制好的胶原酶溶液呢？$ y/ x& ~9 Y% u4 H5 d- m1 \
一般是2-3倍的体积
作者: 相宜    时间: 2012-5-29 23:27

回复 danieldan08 的帖子7 Z+ e7 ]5 P" d* c- v; U

. t. A1 P: k$ P8 h# p. P4 n胶原酶贵呀，我已经做了，用的是等体积的0.1%胶原酶，只要消化时间充足，一额可以消化的很好，谢谢您的回答
作者: meister    时间: 2012-6-25 17:02

回复 zerollx 的帖子6 B/ ]9 F8 G1 N+ M$ z

( ^1 C- |. Z: `! Y' W( }不对头，用缓冲液D-hanks，就可以。 最好不用培养基。
作者: meister    时间: 2012-6-25 17:04

回复 zerollx 的帖子
1 y3 j6 V$ ~# v0 E$ |8 V9 f7 X* n7 M: _0 f
培养基成分比较复杂， 不宜用于胶原酶配置。
3 u4 s2 R* D9 k2 q& |6 i" M# X至于对胶原酶活性的影响具体有多大，不知道， 没测过。
作者: zyqzzf    时间: 2012-9-19 15:40

回复 yxp 的帖子6 z( B" P/ R+ Y4 R4 j! ^

6 U- f1 j# U& H" q& t. K0.075%？就是0.075mg粉末溶于100mlDMEM中吗？
作者: zyqzzf    时间: 2012-9-19 15:43

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( y, n% D4 Y" \+ \- C
- C7 J2 E6 V) \5 T) O9 U我想配置0.075%胶原酶，怎么配置啊？
作者: 细胞海洋    时间: 2012-9-20 01:18

回复 zyqzzf 的帖子
0 n9 W+ ^2 Z( ]7 |: i0 [  ?) C5 n! S! |, m
建议你发新帖提问
作者: biomater    时间: 2012-9-20 18:07

要用D-hanks溶液，
8 k. s  `2 @# A! M$ a6 n% J( R貌似和离子有关系，不能用培养液配制吧!
作者: 牙牙丫丫123    时间: 2012-9-21 18:16

回复 zyqzzf 的帖子
8 r" x  a1 ~9 _9 I$ F& J6 y7 G* `6 D# k' W5 B9 L7 s" U
按照1g胶原酶等于1ml溶液的比例来换算1 z3 |, K8 m8 D4 m; ?- m
作者: tangyihan    时间: 2012-9-30 12:32

回复 zerollx 的帖子
9 B# e8 W( \0 b/ \1 G
; d6 b. P# p7 ?- q) T: c4 V- l配胶原酶，用DMEM高糖完全没有问题，不需要加血清。你看看你的胶原酶的说明书（sigma），上面应该说了可以用血清中和胶原酶，所以个人觉得不加血清配制比较好，胶原酶用PBS都能直接配，DMEM也好，DMEM/F12也罢，都行，过于担心了...
作者: huangcong1988    时间: 2012-10-8 09:30

回复 牙牙丫丫123 的帖子0 t5 M& o% T" g' S" F9 \& s
" j1 ~9 `, J9 R$ d; ]! [
是1mg吧？
作者: 牙牙丫丫123    时间: 2012-10-8 11:56

回复 huangcong1988 的帖子' E6 }7 J$ p$ Q2 U" A- v

6 F; I* z" L- Q5 _: m1g，按照与水换算
作者: 牙牙丫丫123    时间: 2012-10-8 11:56

回复 huangcong1988 的帖子
2 l4 g- J- e& T+ o! ^0 r( ?) E" J) V$ ^8 y- F0 g
1g，按照与水换算
作者: huangcong1988    时间: 2012-10-10 12:30

回复 牙牙丫丫123 的帖子
3 W3 ?! S, m; t3 \
! K  D/ l- X* I' k: l5 Q8 ^# b我是说1mg胶原酶加1ml水，那么1g就加1L水，一般买的粉末胶原酶I就是100mg的，那么加100ml水就是0.1%，你说1g我不是很懂
作者: 牙牙丫丫123    时间: 2012-10-10 14:34

回复 huangcong1988 的帖子* k" C" F8 W6 }. b7 z
4 V0 j- @7 J5 G( M2 C/ i. d
我的意思就是如果要配制1%的胶原酶，那么需要将0.01g胶原酶溶解到1ml溶液中，这里是按照胶原酶的质量1g等于水的体积1ml计算的百分率（胶原酶浓度）
作者: huangcong1988    时间: 2012-10-11 15:55

回复 牙牙丫丫123 的帖子
: O4 A6 Q4 e. p0 `! R3 N6 Q
7 L; g  w0 `9 t' w5 W呵呵，说得太深奥了，半天没理解
作者: ditiger    时间: 2012-10-11 16:03

配制时不能用血清吧，血清岂不中和了胶原酶？应该用无血清培养基配制，0.22μm过滤，-20度保存。
作者: ditiger    时间: 2012-10-11 16:05

回复 ditiger 的帖子3 }! d4 D$ _) _2 R

; K; H# t# s+ m+ j0.2%的配制，50mg(小包装)加100ml无血清培养基，过滤，-20保存
作者: danieldan08    时间: 2012-12-15 22:17

回复 biomater 的帖子7 \* N/ \4 r4 @/ V# ~# s; f
! d5 X' m* N: J
用培养基配没有问题，前期是不加血清。用过了，效果很好
作者: sunflower636    时间: 2012-12-16 09:34

回复 相宜 的帖子; q  D: h# W  A$ b! T( D
0 r% o/ h$ s8 E
5ml的0.1%的胶原酶，摇床中37度，转速160左右，消化45分钟左右。
作者: sunflower636    时间: 2012-12-16 09:35

回复 zyqzzf 的帖子
! T' P  T4 J& p) r# p
3 o$ ^& @! w# f是75mg来溶。
作者: sunflower636    时间: 2012-12-16 09:40

回复 ditiger 的帖子5 K: |5 j7 ~  c
  c. P! S. D" D& k& B/ K: t" _
你这浓度不对吧？应该是200mg溶到100ml中，浓度才是0.2%，你这样浓度应该是0.05%吧？
作者: biomater    时间: 2012-12-31 16:57

danieldan08 发表于 2012-12-15 22:17   ^8 u. ^" B* Y) ]1 V, V) F
回复 biomater 的帖子8 O, q3 R! R, I2 o

) U, u/ s/ F2 o/ O2 W9 F用培养基配没有问题，前期是不加血清。用过了，效果很好
; F/ X! j! d8 U5 m8 ^- w
谢谢受教了
作者: 漫步云端0511    时间: 2013-10-31 10:34

回复 牙牙丫丫123 的帖子
+ P! F: n$ V! s! z& O2 j" a5 t+ X0 Q. B1 E( B
DMEM能于-20℃冻存吗？之前将DMEM置于-20℃两周，溶解后有絮状沉淀。
作者: 牙牙丫丫123    时间: 2013-11-21 14:48

回复 漫步云端0511 的帖子
2 o- R% Q' g0 d; `0 q) o' ^( ]9 m$ S
7 J9 x+ V0 |0 k5 o1 R* a我们这边一般是用KO-DMEM溶解的，我之前冻存过，解融后没有问题，可以正常使用，有时候有絮状沉淀你预热一下就可以完全没有了
作者: zhangjieyctc    时间: 2013-12-3 10:05

回复 翅膀111 的帖子# b0 ?+ E0 G1 k
' z; o3 q7 a* u( P6 _
一般你做脂肪用胶原酶的浓度是多少？消化多长时间？
作者: zhangjieyctc    时间: 2013-12-3 10:08

回复 晓哥 的帖子2 u* f7 D$ `, a3 @

5 ?6 N& g  a% W8 C3 D用PBS配制的浓度是多少？做人脂肪干细胞用的
作者: zhangjieyctc    时间: 2013-12-3 10:11

回复 zyqzzf 的帖子
1 l0 h& P6 d5 `5 ~
% F( p% u  V; r* F* P你用的0.075%的浓度用于做脂肪干细胞的嘛？加的量是多少？？
作者: wf78365421    时间: 2014-2-14 13:12

回复 zhangjieyctc 的帖子
5 Y$ O- x; c! V6 q6 ]$ L7 c2 d
9 g: D$ T6 T3 m4 x: {- D) G与脂肪组织等体积混合
作者: wf78365421    时间: 2014-2-14 13:14

回复 zhangjieyctc 的帖子
8 m/ s; p# c4 @7 T) x" H
& Y1 M% V: A( u9 y有的用0.075%，有的用0.1%，都差不多。0.1%浓度即可。用时与脂肪组织等体积混合，37度消化30min~60min即可。
作者: wf78365421    时间: 2014-2-14 13:15

回复 zhangjieyctc 的帖子% w3 Y7 [% z: d* c5 N+ n) t# m
5 L7 F, U( X. z: R2 C$ z
对于脂肪，有的用0.075%，有的用0.1%，都差不多的，都可以。一般0.1%浓度即可，用时与脂肪组织等体积混合，37度消化30min~60min即可。
作者: wf78365421    时间: 2014-2-14 13:15

回复 zhangjieyctc 的帖子/ v& s* `- j2 g$ r  ]) }6 f
! A# p1 N& E$ a) P. V" @: I
建议用DMEM，效果比PBS好。DMEM不加任何东西。
9 ^6 l* I0 i" I4 [不能用血清配胶原酶。
作者: wf78365421    时间: 2014-2-14 13:16

回复 漫步云端0511 的帖子
9 ?  T( K4 r" {- I( g( Y7 N. Z: Z1 }0 p6 w% O
可以冻存的呀。不会产生沉淀。
! H& {* s7 E/ w" Q1 U" d( g
作者: zhangjieyctc    时间: 2014-2-21 10:53

本帖最后由 zhangjieyctc 于 2014-2-21 10:57 编辑
3 q9 j5 }$ l% d! ~- I1 m* s" W) W6 u5 @  [2 X  J
回复 相宜 的帖子
" f* y+ m- x6 t  I; \
; b1 _8 C2 g; L) N* ?3 {配制的浓度是0.1%？还是使用的最终浓度是0.1%？消化的时候是用恒温摇床的嘛？消化多长时间？
作者: weychui    时间: 2014-11-10 18:46

回复 临床干细胞 的帖子  {$ ~- V" @5 q8 B

% s* d2 i; a  ]0 u: e为什么不用高糖啊？我养的用的就是用的高糖的啊，长的还可以啊



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