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标题:
求胚胎干细胞的冷冻方法
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作者:
congxiaoran
时间:
2011-4-27 11:45
标题:
求胚胎干细胞的冷冻方法
请教下如何冷冻干细胞 怎么操作和需要哪些液体 谢谢
作者:
nculsa747
时间:
2011-4-27 15:43
自己先找一下嘛，非常简单。90%KSR+10%DMSO。细胞冻存液有现在的，如cellbanker、millipore都有，去找一下吧。
作者:
王乾
时间:
2011-4-28 13:18
不同实验室有不同的冻存方法，其实只要是操作没问题，没有太大区别，下面是我们实验室的冻存液的配方，和冻存即复苏方法，希望对你有用。
* a8 K& C0 k6 b% ~2 a9 Z1 Z
细胞冻存（缓存）
' y8 L+ a E+ j/ \: x& j0 N0 F
1、0.25％trypsin（或＋0.02％EDTA）消化5min左右，镜下见细胞回缩间隙增大，即可吹打脱落。
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1、800r离心5分钟，2次（无EDTA，离心一次即可）
* r& }1 m# L& U9 _5 ]' ^ b1 r
2、配制冻存液：甘油:血清:完全培养基=1:2:7
1 R7 u+ @3 U5 G7 [
3、50ml培养瓶的细胞（约5×105），用1ml冻存液重悬细胞，放入冻存管中。
+ F0 \) t6 y# z- e ^' o
4、冻存步骤：4℃1h——－20℃1h——-－80℃1h——- -196℃液氮冻存。（冻存细胞程序性降温，4℃放置时间40min以上，3h以内，－20℃对细胞损伤最大，1h左右为宜。）
: i7 q" D, y) q8 ?3 s: ]1 r
% }6 V$ q& o. P9 n- ^% T2 `
细胞复苏（速溶）
" K# {: F- s9 z0 r
冻存管直接投入37℃水浴，平摇直至融化，种于50ml培养瓶中。根据细胞贴壁情况换液（一般24-36h换液）。
& `: ~" _% h: k( f% i
计算存活率，取一滴冻存细胞悬液，台盼兰染色，活细胞不上色，死细胞染成兰色，计算细胞存活率。
2 T/ i6 z$ x# V4 w9 Y8 m7 P
（细胞总数－死细胞数）/细胞总数×100％
6 F/ ]5 _! W' I: [+ a
作者:
随心
时间:
2011-4-29 15:47
这边做的是小鼠胚胎干细胞，用3.5cm板养的，具体步骤如下：
) T2 y+ C S2 s$ t6 Z# A4 F
1.提前将保温杯放入-20℃待用.
. m2 V$ Z9 T8 E, `
2.提前两小时给干细胞换液.
5 T; u" L+ w# S5 N3 W. T
3.开始冻存,把培养基去掉,用pbs洗一至两遍，加1ml胰酶消化1min。
8 k: d2 N# b% c% P* Z- l
4，去掉胰酶，加1ml培养基把细胞吹打下来，加入离心管，1000r，一般我们离7min。
1 {" [1 } k1 K: |+ o
5.加入1ml培养基吹打均匀
- B. b7 C" f! Z
6，加入10%-15%的二甲基亚砜，根据细胞的多少，大概冻几管，计算好DMSO的量。一般一管2乘10的六次方左右最好。
; s# T% L7 M; P- O
7，分装冻存管，每管大概总液1ml.
' |% K5 d7 T; y7 |3 F
8.把冻存管放入预先准备好的保温杯中。
5 w8 ^/ h& p, }+ x' j: [5 p2 w
9，送至-80℃过夜。
o0 ~ D" U0 E5 U) _2 l$ Y% h) Y |
10.第二天一早转移至液氮中，做好记录就可以了。
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我们一般晚上冻存，这样做完直接送至-80℃过夜了，时间正好。
作者:
congxiaoran
时间:
2011-4-29 17:53
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王乾
的帖子
& l5 I: Y! n0 @+ N
* F Y. _" i9 D, o
非常感谢
作者:
congxiaoran
时间:
2011-4-29 17:53
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随心
的帖子
+ n& j- L' @ G/ s: { w
4 o# \' j4 N* Q- u( K8 D! S, b, _
多谢 受教啦
作者:
congxiaoran
时间:
2011-4-29 17:53
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nculsa747
的帖子
1 b$ d7 T* Q8 v5 V% z4 k5 a
8 D# y* y8 L" u0 A
谢谢
作者:
congxiaoran
时间:
2011-4-29 17:55
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nculsa747
的帖子
/ D8 r+ j+ U& i2 W' L7 O* M8 H
8 m, I( O8 t, v4 W
不好意思想问您 KSR是什么？应该买哪个牌子的？多谢
作者:
HMC
时间:
2011-4-29 18:02
最好使用10%DMSO+90%FCS进行冷冻，这样效率更好！
作者:
nculsa747
时间:
2011-4-30 13:13
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congxiaoran
的帖子
' j" J6 g f3 M7 o, k8 V+ i
* J' S4 y" H$ X2 w, D
knockout serum ,血清替代物，Gibco的。9楼说的FCS即FBS，hESC最好不要用它。
作者:
congxiaoran
时间:
2011-4-30 18:55
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HMC
的帖子
2 M3 X5 l2 [$ z: P; E" L3 Q q% S4 r
% ~6 T) t- I- x8 }8 s: t
谢谢啦
作者:
congxiaoran
时间:
2011-4-30 18:56
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nculsa747
的帖子
2 V1 G0 N# C2 o8 z2 ~
. ? A/ N* C, L1 Q: o8 }
还想问下您 那knockout DMEM 是不与SR匹配使用呢？
作者:
nculsa747
时间:
2011-5-2 13:25
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congxiaoran
的帖子
/ I3 A" z6 z t1 p4 Z {$ T
5 Z3 V! h! o7 }( P2 c
不错，是这样的。 it optimized for hESC culture.
作者:
yylhxylong
时间:
2011-5-2 16:14
小小补充一点，如果你把细胞装进小管里面保存在液氮中的话，记得用内旋的小瓶子，用外旋的液氮有可能进去，然后cell就死翘翘了~
作者:
nculsa747
时间:
2011-5-3 15:20
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yylhxylong
的帖子
$ @( Q0 n3 [0 s* L* H3 \3 v, E
0 M2 T/ I0 I0 S9 E4 v; [' t- t; ?
我们用的就是CORNING的外旋2ml的管子，没有问题啊。不过你的想法是正确的！
作者:
almasun97184
时间:
2011-5-4 09:57
玻璃化冷冻是最高效的，人的ESC的复苏率都可以达到80－90%。价格较高，且麻烦，只适合用建系之初。
. p0 b" w8 s w7 |
普通hESC培养冷冻用10%DMSO+40%SR+50%完全培养基。
! g, x( |+ ~/ Q4 _: q" a' H
mESC培养冷冻用10%DMSO+40%FBS+50%完全培养基。
' J p0 h" ?* i* C, E4 S
程序冷冻最好。没条件的用冷冻盒直接放到－80度冰箱，可以缓慢降温。再不济的4度放两小时，直接丢到－80度也可以，复苏率稍微低一点儿而已。
' o% f& R6 ~2 R9 V7 E0 T
作者:
congxiaoran
时间:
2011-5-4 21:12
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almasun97184
的帖子
% H* ^3 j$ A& e! y
0 P/ q9 b8 ]1 s8 R
谢谢
作者:
sheepthief
时间:
2011-5-4 21:26
有没有用全培养基+100% DMSO冻存的？
作者:
sheepthief
时间:
2011-5-4 21:27
另外，放在-80摄氏度后一定是只能一天吗？两天可不可以？有什么影响没? 谢谢
作者:
almasun97184
时间:
2011-5-5 08:16
全培养基不好，起码要50%血清或SR（完全培养基中有20%血清）
. n& h$ R% M6 [ V0 T
其他的成体细胞或细胞系在－80度放半年都可以，hESC最好不要。
作者:
czzhaozhu
时间:
2011-5-27 16:39
小鼠ES冻存比较简单，而人ES 冻存最好采用程序性降温来冻存，冻存液配方为10%DMSO+80%SR+10%KO-DMEM。
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