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标题: 293T细胞的培养 [打印本页]

作者: huangcong1988 时间: 2011-5-26 08:48 标题: 293T细胞的培养

这是之前看到的，别人做过的，关于293T细胞的培养的主要过程，在此，与大家分享一下：$ S6 T: t: R( d
（一）293T细胞的培养9 E3 t. G& Y1 \  j0 R0 I  W& e7 [
1.293T细胞计数: s" s# K: D) }( q6 G
6 V, S4 J" o# m" E$ n8 p
用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000个/ml,在0.1ml的细胞悬液4 V  U' V; N: g4 a) R  `
中加入0.1 ml的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数, b3 K- V  z' d5 Q- F
细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。
2.293T细胞冻存
（1)取培养2～3d生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成2×106-2×107/ml
（2)在1 ml细胞冻存管中加入0.5 ml细胞悬液，0.4 mlFBS和0.1 mlDMSO，混& x7 M7 A9 P/ q$ W3 W! L6 A  h
匀后密封。置4℃10min，-20℃30min，然后直接放入-70℃保存。6 U+ ^& H# {( O9 B( ]2 R

3.293T细胞复苏! z3 `" ~' n0 W3 R3 @5 U5 ~
（1)从液氮罐中取出细胞冻存管，应带有防护眼睛和手套。, G  C9 m6 H3 f/ K# h) k' J2 y
（2)迅速放入盛有37℃水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。( r& D6 n" p5 c' O8 J
（3)用70%酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出细胞悬液至培养瓶中，补加3ml
含10%FBS的DMEM培养基，置温箱培养。5 o; m% Q9 u0 U
（4)次日更换一次培养液后再继续培养。
4.293T细胞传代5 f/ V& z3 g! j) i3 P* V
（1)弃去旧培养液，加入5 ml灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然
后弃去PBS溶液。
（2)加入2 ml胰酶消化液，消化1-2 min直到细胞完全消化下来。( V" F- O/ n9 e! s9 k: v0 [5 Y/ b7 X
（3)加入含10%FBS和100 U/ml双抗的DMEM培养基5 ml，用刻度吸管吹打数次，. P" D5 a7 ~; F" [
将瓶壁上的细胞冲洗下来。
（4)混匀细胞后分至两个新的培养瓶中，继续培养。( Q1 I# Q5 Z8 N4 r, _5 R8 [& z- J7 v

作者: nihaohao 时间: 2011-5-26 10:30

谢谢分享

作者: sailor 时间: 2011-5-26 11:59

谢谢分享补充一个小tip 我们实验室要求复苏293t时候一般会离心去除DMSO

作者: huangcong1988 时间: 2011-5-26 12:54

回复 sailor 的帖子
+ R; @. `- j1 H( \' T
也谢谢你的tip，呵呵

作者: ningtinglu 时间: 2011-5-26 22:06

补充几点：1.冻存时先放入冻存盒中，缓慢降到-80度，再转移到液氮罐中；
               2.复苏的时候操作要快，防止DMSO对细胞的毒害作用，另外要离心去DMSO;' N- A/ H2 g- J# K; o$ x* z
               3.传代时胰酶我们用的是有EDTA的，终止消化后也要离心除去的。5 z& \  p$ }8 a8 _$ R
               4,。培液和PBS要温预，要对细胞好一点。冷的PBS容易是293直接飘起来，都不用消化了。。。。:)

作者: 牙牙丫丫123 时间: 2011-5-27 19:31

想问问你们在培养293T的时候细胞中有没有出现过小黑点，这种东西会增多。这样的情况在细胞转染后特别容易出现。

作者: 牙牙丫丫123 时间: 2011-5-28 14:16

回复 huangcong1988 的帖子
+ U; g# `( R9 j1 m
想问问你们在培养293T的时候细胞中有没有出现过小黑点，这种东西会增多。这样的情况在细胞转染后特别容易出现。 ' L- J) c& V- e' |, p! ~

作者: huangcong1988 时间: 2011-12-23 10:36

回复牙牙丫丫123 的帖子1 I. t; y. S6 e
* E! X! t7 [/ n/ ]5 c
恩，是的，当293T养得比较稀的时候，细胞里面是会出现很多小黑点，不过当细胞密度大起来以后，这些小黑点就不明显了，我觉得这些小黑点可能是黑胶虫，细胞密度稀可能有影响，但是细胞密度大了之后，这些小黑点对于细胞就没什么影响了，现在的293T细胞株中多少会有这样的一些东西，不过，个人觉得影响不大

作者: sccs1046 时间: 2012-1-9 15:01

回复 huangcong1988 的帖子" v7 ^2 ~2 T7 J9 x3 h0 W

我养的时候也有这种情形，刚传后细胞中黑点比较多，当细胞长密后，黑点就不见了，不知道是什么原因，不知道会不会影响细胞转染什么的？

作者: huangcong1988 时间: 2012-1-9 16:51

回复 sccs1046 的帖子, p9 [9 a- x4 Q; I
$ W0 V7 ~5 r7 a# l" p
我觉得这些小黑点对于之后包毒影响不大，因为细胞密了之后小黑点就少了，还有就是小黑点与细胞是竞争，也是共生的，所以细胞密度一定要保证，不然细胞会不太好长，所以消化传代那些一定要保证细胞密度

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