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标题: 关于小鼠胚胎干细胞培养 [打印本页]

作者: chliu 时间: 2011-5-27 09:01 标题: 关于小鼠胚胎干细胞培养

在培养胚胎干细胞的时候，为了防止其分化，传代时需要将细胞打的很散，然后稀释。请问大家都是用什么方法将其打的很散的呢？

作者: username 时间: 2011-5-27 09:26

关键是胰酶消化要彻底一些，如胰酶处理不好，你很难吹打成单个细胞悬液。胰酶消化前用PBS洗细胞一次，用0.25%胰酶消化几分钟，镜下见细胞悬浮，反复用吸管吹打数次即可，再用血清灭活胰酶、离心。离心后再悬浮细胞，用吸管反复吹打数次。

作者: esc123esc 时间: 2011-5-27 10:42

胰酶浓度其实0.05%就够了，只要能将细胞很快的分散开，胰酶浓度可以尽量低一点比较好，PBS洗一下，再加入胰酶，一两分钟之内很快就可以了，敲一敲培养皿，用枪尖多吹打几次，，消化的时间最好不要太长了，如果你用血清养的，加血清终止，如果无血清养的可以加TI 终止

作者: genedu 时间: 2011-5-27 17:47

楼上说的比较对，不太同意一楼的观点，胰酶对克隆的影响还是有的，一般能用低浓度的就不用高浓度的，能用温和的就不用烈性的。0.25%和0.05%的胰酶以及胶原酶我都试着比较过，但是比较好的我感觉还是胰酶替代的tryple，三分钟，血清终止，离心，在吹打的时候我建议用1ml的枪进行吹打，这样会比较彻底，不会有块状出现。

作者: 前途似锦 时间: 2011-5-27 18:12

genedu 发表于 2011-5-27 17:47 ]2 c5 G; b" E9 u* N
楼上说的比较对，不太同意一楼的观点，胰酶对克隆的影响还是有的，一般能用低浓度的就不用高浓度的，能用温 ...

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对对我觉得一楼的方法对细胞的损伤可能不小，要是用0.25的也是加上，洗一遍马上吸出来，残留的消化就可以了，大概30s就可以了，终止，吹打就好了。

作者: chliu 时间: 2011-5-27 23:50

本帖最后由 chliu 于 2011-5-27 23:54 编辑

我们用0.25%的胰酶处理20分钟，培养基终止，用吸管抵住培养皿的底部使细胞挤出来，反复很多次，结果传代后的细胞还是长3-4天左右便有个别地方clumps出来，长得还是不是很平，不知是什么原因呢？是没打散么，可是我们胰酶处理的时间已经够长的了，挤得也很厉害了

作者: shqinzhu 时间: 2011-5-28 21:58

0.25%胰酶20min?
我们一般是胰酶1.5min
将培养皿倾斜，就用枪头从上向下划弧形轻轻吹打，一般都很匀，放培养箱前先镜检一下，应该能都防止没有吹打散的情况。

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