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标题: 流式免疫荧光检测 [打印本页]

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作者: future007    时间: 2011-5-30 09:23     标题: 流式免疫荧光检测

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7 k9 V6 ~+ \% P' r4 q( t) c. K我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢下结论，第二次和第三次就怎么都染不上了，具体的方法，如下：
4 w/ F* @+ ^/ _! R! M6 A①        收集2×106个细胞，用冷的PBS 2 mL 洗涤细胞1次，800 r/min离心5 min。6 ?$ x- G' b# I: a- n+ S$ j
②        用2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min，800 r/min离心5 min；2 mL PBS重悬细胞，800 r/min离心5 min。4 \0 O" y$ I' E4 l7 f8 o
③        用1 mL含0.2% Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10 min，800 r/min离心5 min。
# y0 w/ z/ X! P1 O& s: M④        加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40 min，800 r/min离心5 min，用2 mL冷的PBS 重悬细胞，800 r/min离心5 min，洗去未结合一抗，重复1次。% e- h& ?/ O" I1 c! o  t8 c, {8 V
⑤        加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40 min后，800 r/min离心5 min，去上清，PBS洗涤2次。
4 p- y1 c! Q) R% Q8 ~& K6 S⑥        加入0.5mL 1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。
. i$ X2 ~' N+ x! g( V⑦        流式细胞仪检测荧光值，每管计数10000个细胞。' y, j2 I0 ]- H3 u
我想让大家帮我分析一下，是哪里出了问题才可能导致我的样品都没有染色就是阴性结果，一抗二抗的种属问题不存在，一抗兔源二抗是驴抗兔的，没有问题。通透液配置时间不超过十天。多聚甲醛商品化的，反复冻融三次。二抗避光4度保存。一抗是1:500稀释，二抗1:1000稀释。0 ?2 z6 J! K5 X* F
我实在想不出来是哪里出了问题了，希望大家帮帮我。谢谢了。

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作者: jhu132llh    时间: 2011-5-30 09:38

好像是没问题的呀9 C8 g# N# g- i* \0 S; o
看来你有悲催了+ n) x4 g& J9 M
要不在试试做一次

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作者: future007    时间: 2011-5-30 09:45

回复 jhu132llh 的帖子4 `" O' k2 H/ W# H# u( ]% `7 Q

( Q  a" e4 P7 y2 q+ o8 x+ H; f: }我都疯了，做的叫个郁闷呐，死的心都有了
% l3 V3 b" d# S0 N6 R4 z

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作者: czzhaozhu    时间: 2011-5-30 10:15

你的样品都没有染色就是阳性结果，那你试试不加任何抗体，收集细胞技数后就上流式看是何情况？

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作者: lizzy_81    时间: 2011-5-30 11:48

我每次流式都是没有固定直接做的，而且，一抗二抗用的直接标记的，这样做既方便，结果还比较准确，就是不知道这种直接标记的抗体是不是贵一些

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作者: future007    时间: 2011-5-30 12:40

回复 czzhaozhu 的帖子4 f( d6 N0 b8 I% I' {5 s. Y

, s, K) {7 G7 J) N* c" S! k说错了，都是阴性，不好意思

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作者: future007    时间: 2011-5-30 13:53

future007 发表于 2011-5-30 09:23 ) e0 J  H4 \5 e
我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢 ...

/ h3 b. T% q4 @& x
上面说错了，我的结果全是阴性，不是全是阳性，对不起了

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作者: 细胞海洋    时间: 2011-5-30 15:12

回复 future007 的帖子: @$ c3 f) v, c  f! O+ V# [0 \
- b' \/ E. [7 v6 C, O8 J- ^/ c
具体说一下修改哪里？ 我帮你修改

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作者: a86856635    时间: 2011-5-30 15:22

抗体孵育直接静致是否结合不牢。整个过程都应该转盘悬浮比较好吧

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作者: daviddow    时间: 2011-5-30 17:15

2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min?为什么要固定？

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作者: guosapphire    时间: 2011-5-30 17:46

首先，你需要弄清楚你的抗压位置，是胞质还是核内？位置不同可能需要的透膜时间有所不同。' F3 D2 K; _9 G
然后，找个阳性对照来判断你的操作有无问题；  x* z' [5 B6 B
最后，你可以尝试延长一抗，二抗的孵育时间和温度的改变。个人认为，既然你的细胞染色前已经用PFA固定了，根本就不需要后面的冰上操作了。0 |2 w4 }; j) S4 u5 g% R

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作者: future007    时间: 2011-6-1 11:16

我做出来了，不过都修改了很多地方，说出来和大家分享一下啊。4度固定8小时（可能不需要这么长时间，但是我是为了调整我的作息时间）0.2%trition+5%山羊封闭血清通透15分钟，一抗4度过夜孵育，二抗室温两小时孵育。就可以了，以上是我改进了的地方，希望以后做流式分析的同学可以借鉴。能少走点弯路，谢谢大家的帮助

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作者: future007    时间: 2011-6-1 11:18

回复 daviddow 的帖子
% I7 ^6 V) i$ G+ }' E1 V
; V+ E  ?: J% k% [$ E我查的一个外文的方法，具体网站我记不得了，不过很多相关的方法都需要固定，你说的不需要固定的那种我也见到了。不过我选择了保守方法，呵呵

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作者: future007    时间: 2011-6-1 11:19

回复 细胞海洋 的帖子% ^% ~7 |. w8 }  R8 q

是哪里出了问题才可能导致我的样品都没有染色就是阳性结果

中的阳性改成阴性就对了。谢谢斑竹

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作者: 细胞海洋    时间: 2011-6-1 11:45

回复 future007 的帖子% A% Q7 D( Q/ i! x5 B( _

+ b8 [" A: B# A; [# m/ [已经修改 看一下

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作者: future007    时间: 2011-6-1 14:30

回复 细胞海洋 的帖子' K) d8 B2 i, ~$ ~. `7 R6 r# E
4 v/ x; {2 k0 M) z. r% ]5 ]
谢谢斑竹，已经改过来了

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作者: 骨道边    时间: 2011-6-20 23:36

做流式为什么要固定呢？固定细胞是为何？

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作者: RIVA2011    时间: 2011-9-16 16:38

首先，第一次和后两次的染色方法一样么？有什么差别？为什么第一次阳性，二三次就阴性了 ?+ Q1 i) i- f& {4 I7 u6 h2 ^
你的方法中，我有几个疑问：
$ b/ A8 E3 L  h②        用2 mL 4%多聚甲醛室温（为什么要固定？）固定细胞40 min，800 r/min离心5 min；2 mL PBS重悬细胞，800 r/min离心5 min。
8 ^$ v! X4 L7 W; b③        用1 mL含0.2% Triton-X100（检测的是胞内的？）和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10 min，800 r/min离心5 min。+ G+ U. ]9 u$ ]* }

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