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标题: 新手有个问题？ [打印本页]

作者: 如来的观音 时间: 2011-6-2 21:16 标题: 新手有个问题？

打个比方说，研究干细胞向终末细胞分化，我们可以从蛋白方面和基因方面来鉴定是否分化。蛋白方面可以做类似于western的检测方法，蛋白标志物可以做免疫荧光、流式等，基因方面可以做PCR等，那么怎么选择半定量PCR、实时定量PCR还是逆转录PCR呢？

作者: grape 时间: 2011-6-3 08:55

首先明确三者的原理及差异：
$ U' g+ X% [0 ~8 V
1、逆转录PCR（reverse transcription PCR, RT-PCR）：
由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖RNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。

2、半定量PCR（semi-quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR）:
是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。以半定量RT-PCR为基础建立起来的mRNA含量测定技术，较含内标化的RT-PCR定量测定的mRNA的方法更为简便可行。这种方法不另设‘内标准',排除了俩对不同引物之间的相互抑制和灵敏读差异，而且具有明显的剂量－效益关系和良好的重复性。& T) @* }& D! R- R' O, c; ]4 W

3、实时定量PCR(real-time quantitative PCR, RTQ-PCR)：7 l! s% P. v$ e* t0 H; h
RTQ-PCR属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。real time PCR 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。一种是在ds DNA中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。real time PCR 与 reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。2 q$ ?* r7 k& p: Z& K* U  C

三者区别：
1、半定量RT-PCR与荧光定量Real-time PCR最大的区别就在于 semi-PCR需要跑电泳，根据条带亮度的强弱来判断模板拷贝数的高低或者是表达量的高低；
而Real-Time PCR则无需电泳，可以实时监测整个PCR的全程并且由给出的Ct值及Standard Curve来判断gene拷贝数的高低；可见 semi-PCR不如Real-Time PCR精确。( D1 C" y2 I) l) \' u! f
/ O  g- T, K8 G# Q
2、RT-PCR只能通过模板pcr后扩增的结果间接的反应初始模板的量；
而realtime-pcr的结果直接可以看到初始模板的量。所以real time-pcr更精确些。9 f$ U! K. z9 Y  C% w! Z
# `3 m$ q" g8 w3 E; D+ L
个人认为，三者操作方法虽然有所不同，但基本原理类似、殊途同归。对于研究干细胞分化，没有选择哪种更好的必然性。个人认为如果有条件的话，选择实时定量PCR更精确些。

作者: 如来的观音 时间: 2011-6-4 00:29

回复 grape 的帖子7 s* ]! w1 {5 h9 y, i) m

非常感谢

作者: iamwentworth 时间: 2011-6-4 00:34

呵呵

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