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标题: 八一八，为什么养个MSC总是有这样那样的问题 [打印本页]

作者: 飞翔的十字架 时间: 2011-6-7 14:35 标题: 八一八，为什么养个MSC总是有这样那样的问题

本帖最后由飞翔的十字架于 2011-6-8 10:08 编辑

接触MSC已经两年了，从看着师姐做到自己独立操作，和许多论坛的朋友一样，碰到了不少的问题，也经常上来请教。不断的碰到问题，不断的学习，不断的解决，现在就以大鼠的骨髓间充质为例，和大家八一八培养中的一些问题和我的经验，希望和大家共勉，养出好细胞。7 h+ T0 s( w7 O- w0 S9 }; ^

细胞取材：0 j; v2 U3 c. R
既然我们提的是原代细胞，而且是需要纯化的，那么细胞的供体就至关重要。理论上MSC约占骨髓细胞的十万分之一，与供体的年龄有关。但我提细胞的过程中，经常遇见老鼠骨质的异常，包括骨质增生，骨质疏松以及软骨化，虽然我没有跟踪统计从这些老鼠骨髓中提取的MSC的情况，但不可否认的是这些老鼠的身体状况或者说是它们的骨质除了问题，进一步提出这样一个问题：难道能从这样病态的老鼠骨髓中提取的MSC不会和正常的有差异吗？- `. D- q/ y# \4 ~: b% u/ Y/ D
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我在重庆和北京都做过MSC，从不同的单位购买过大鼠，结果提取的细胞大相径庭。我从某个单位前后买了近20只大鼠，无一成功，不是没有细胞就是长的奇形怪状（不点名了，怕人家找我拼命）。而即使从一家单位买到的大鼠，这次做成功了也绝不代表下次也能成功，在培养条件完全相同的情况下我只能分析说是老鼠的差异导致的。我现在的做法就是一次买8-10只大鼠，一下午搞定，只要能从2-3只中提取处状态良好的MSC就心满意足了。, ~* U4 d) }0 G" ^% J# c

我曾经和同学说的：能不能提出好细胞，在你做出要杀哪只老鼠的选择时就注定了！
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培养体系：
有了好的细胞来源，你还需要给细胞一个很好的营养环境。一般来说就是培养基＋血清，或再加点双抗，glutamine和其他生长因子等。$ X6 h4 [* P; \, \ E3 B% g4 x
先谈谈培养基吧，一般大家为了方便都是买的液态500ml装的，不过某研究所老师告诉我，他们一直是用粉末自己配的，因为粉末一般在运输途中也是－20保存，比起液态的4度保存其成分会更加稳定。有一定道理吧，但总是觉得麻烦，而且我也曾买到假货。不过我认为液态的问题也不大，注意开瓶后别用太久就行。
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血清，大家公认的MSC培养中的重中之重吧，问题也最多。从做MSC开始，筛过很多血清，相信很多人也做过。国产血清确实质量不怎么的，偶尔有几个批次好一些，但总不能长久或不稳定（有个国产血清还是不错的，用过一段时间还可以，不点名，有广告嫌疑）。但进口血清呢，国内市场上的假货太多了，越是大品牌的血清假货越多，因为利润高啊。即使你是从那些大公司的官方代理购买，也很容易买到假货，甚至有时比买到真货的概率还要大，假货怎么进入到流通渠道的？从公司高层往下一直都有可能，甚至是送货人员，他把你的货给换了，结果你和公司怎么也扯不清。其次，我一直怀疑西方对中国的血清使用是否有限制。我们都知道，某著名品牌的血清都是澳洲或新西兰来源的，可为什么不卖美洲的货呢。我从特殊渠道搞到这个品牌US的货，不贵，500ml人民币1800，结果很好用，比走官方代理的澳洲货好多了（你们别和我打听哪进的，特殊渠道，呵呵，不能砸了人家的生意）。告诉大家一个小秘密：Gibco血清瓶子底部边缘处是有一串很小的数字的，大家回去看看哦。总之，我的经验，进口血清肯定比国产的好一些，但你一定要找到一个长期固定且能给你搞到真货的供货商，不然你还是用国产的吧，总比假货好。国产的好血清1.5元/ml算不错了，太便宜的就算了吧。+ m9 a) ]) @' j$ f+ ^
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其他因子：双抗我是不加的，操作比较细吧，不污染（小得意下），有人说双抗对MSC不是很好，没有证据，大家自己琢磨；glutamine，我一般也不加，主要是我的培养基用的超级快，跟喝的差不多，要加的话我建议，比如你的培养基要用7天，等用了3，4天了再加点，这东西太容易降解，有条件就用Glut Max替代。生长因子，我现在一般加1ng/ml的bFGF，和别人学的，没有充分实验证明它的效果，求个心安。8 k- v6 J" J9 K8 E& v9 Q/ D

Protocal：
刚开始做MSC，要不师兄师姐带着做，要不自己看现成的protocal摸索。Nature 上那个MSC 提取的protocal也就这么几行，读几遍也就会背了，可100个读者心里有100个哈姆雷特，那些蕴含其中的细节未必人人都理解的到。老鼠断颈处死暂且不说，取出胫骨和股骨，怎么取，每个人都不一样吧；把骨髓冲出来，怎么充，有人把骨髓冲出来后再吸再充，有人每一下冲洗用的都是新鲜的培养基，对细胞会有不同的影响吗？第一次换液什么时候，8h？24？72？全量还是半量？没有谁对谁错，个人理解不同，操作习惯不同，能养好细胞就行。养细胞就像养孩子，肯定有许多问题（那些一直养的很顺的就别拍我了），别人的protocal可以学习，可以照做，但重要的是我们要总结出自己的protocal。遇见问题也很正常，我们可以多方求教，集思广益，但在你问别人之前，一定要有自己的想法与主见。& ^+ m, \; Z: \
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细节决定一切：( r( \. e5 @' ^2 a
也许养细胞是一个运气活，但它一定是个技术活，特别是所谓的干细胞，他们太娇嫩了！在这里，细节就显得十分重要了。举几个例子：给细胞换液前要热培养基，你要热多久？短了温度上不来，长了glutamine快速分解，它的分解产物对细胞是很不好的，如果你将培养基遗忘在水浴锅过夜，恭喜你，配新的吧；你的血清反复冻融过吗？拿了40ml分装的血清没用完怎么办，如果短期内你还要用，把它留在4度吧，急着配培养基血清又忘了提前化怎么办，直接放冷水里化吗，拜托，好好计划你的实验好不好；被让你的细胞在胰酶里呆太久，不好消化的时候磕磕瓶子，对细胞的刺激肯定比胰酶少；我见过最恐怖是移液管把细胞悬液吸起来还过了两遍火，说是灭菌，我可怜的细胞你死的惨啊，凡此种种...: l v; [; \$ w3 v* s1 m4 {

有时候细胞长的不好其实是很正常的，长的不好，分析下原因，积攒下经验，也不要钻牛角尖一定要知道为什么，它是细胞而不是机械，而且是我们了解的并不透彻的细胞，人还有头痛脑热身子不爽的时候，何况是细胞，还是娇嫩的干细胞。况且就我开头说的，可能你提的细胞里就是没有MSC或很少。怎么说呢，多实践，多积攒经验，那么养出好细胞的把握也就越来越大了。

叨叨了很多，其实也就一点心得与坛友共享，望大家都能养出好的MSC。

作者: 郝晓英 时间: 2011-6-7 15:58

本帖最后由郝晓英于 2011-6-7 15:59 编辑 3 R2 ^9 O8 y1 z4 r! g/ L
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呵呵  不可置否你说得很激动啊
但是我觉得如果你能把很多细节tips写出来跟大家分享  那就更好了啊

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比如消化时间胰酶用量等等

作者: 飞翔的十字架 时间: 2011-6-7 16:24

给晓英姐加个分欢迎参加讨论

作者: 大少爷 时间: 2011-6-7 17:24

楼主确实有够细心了，不过我们目前都用无血清的培养基了，且在培养时也不加双抗，它对细胞有伤害。

作者: illidancui 时间: 2011-6-7 23:33

顶一下

作者: leungyk 时间: 2011-6-8 10:35

謝謝分享！我就是要獨立操作的一個！0 \; O8 n5 L* ^ x- ~
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想請教："急着配培养基血清又忘了提前化怎么办，直接放冷水里化吗 "0 Q5 r2 s# x/ g7 C
你的意思是~ 要從-20C放到4C一晚，讓它慢慢溶化嗎？
我也想好好計劃我的實驗~可惜我是做臍帶的，孩子出生並不由我好好計劃..

作者: 飞翔的十字架 时间: 2011-6-8 13:13

回复 leungyk 的帖子3 c* w5 i' w) ~1 I

invitrogen 的血清使用指南：
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血清从冷冻箱拿出后，先置于2-8度冰箱使之溶解，然后再室温下全融+ f) ~; A: G- s0 f7 f
融化的血清若存放于4度勿超过一个月

作者: 郝晓英 时间: 2011-6-8 14:37

飞翔的十字架发表于 2011-6-7 16:24
- t! t4 ?5 A! a# @2 z给晓英姐加个分欢迎参加讨论

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谢谢哦哈哈

作者: 生物化学zy 时间: 2011-6-8 15:59

培养液每次用时从4度恢复到室温可以吗?还是必须是37度预热?

作者: ytumuyangren 时间: 2011-6-8 16:19

对于说到培养液的问题，我们实验室用的都是粉末状的，自己配，效果很好，而且储存的时间相对比较长一些，当然在没用完的培养液不定期要加入谷氨酰胺，而且粉末状的在运输过程中比较方便。还有血清的问题，很同意你的观点，国产的的确不咋地，我们就在这上面吃过亏，可怜了我们的细胞，不过现在我们都用进口的，而且在特殊的MSC细胞培养过程中，我们都用hyclone的，这个血清应该是南美产的，欧洲产的血清我们老板不让我们用（怕疯牛病，呵呵）。另外，我们养MSC取的材料都是胫骨处，我们也不用培养液去冲洗，直接将经过酒精浸泡的胫骨放入培养液中，用灭过菌的止血钳或者骨钳将其夹碎（尽可能的碎），然后直接将培养液和碎骨一起种到培养皿中（当然大块的骨头还是要去掉的），3-4天后晃晃瓶子，让没有贴壁的MSC贴壁，5-6天之后再换液，这样操作完后，污染的机会很小，在我老板给我们示范之后，只要我们培养的MSC个个都长的很好，而且从来不加双抗。我们实验室的一点经验，呵呵，预祝大家的试验成功！

作者: tingwuyu 时间: 2011-6-8 16:31

我用FBS之前都是提前一天从冷冻室里移到4度冷藏室内，用前半小时或1小时再拿出来

作者: 飞翔的十字架 时间: 2011-6-8 16:45

回复生物化学zy 的帖子/ F' ?3 Z: d8 T5 P$ M/ B k* E
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夏天的话我一般直接放室温5 u1 Q2 Z# B/ g+ ^5 k3 p
冬天会放水浴，但也就15min差不多了
其实培养基不到37度不会对细胞有损伤，换完液放孵箱温度很快就上去了

作者: 福牛 时间: 2011-6-8 19:25

想请教下楼主，对于骨髓间充质细胞的纯化有没有好的办法，目前我只是控制传代时消化的时间来纯化一下，剩下的就让培养基选择一下……，但感觉这些方法都不是很满意，不知道有没有更好的方法来纯化BMSC。

作者: 飞翔的十字架 时间: 2011-6-8 20:25

回复福牛的帖子
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我的经验：% v3 `: y9 I' }, O- F
24h：全量换液去除悬浮细胞；, ^: {/ D% I/ Y1 L' m1 c: d5 k
72h：加PBS稍微震荡再换液；
之后换液视细胞状况用PBS冲洗；
消化时弃去难消化的细胞；& Q, H2 P8 ~( I! I9 H: Z
细胞状态好时P2就很纯了一般P3都没问题（流式结果）: R# s+ i# f3 @

一家之言，ls可以试试，关键是找到一个自己最有把握的方法

作者: nightvsday 时间: 2011-6-8 22:11

新版主很活跃啊。。

作者: 倒腾细胞 时间: 2014-5-29 10:25

话说好像给细胞换液的时候没见师兄预热，这岂不是大失误？

作者: yiyi8909 时间: 2014-5-29 10:54

“老鼠骨质的异常，包括骨质增生，骨质疏松以及软骨化”如何看出来？实验室自己养的老鼠，前一段做的很好，这一段贴壁率很低，一直找不到原因，换了n个人还是不行。另外关于MSC培养基的选择，楼主有什么建议吗？低糖？高糖？D-F12？

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