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标题: 细胞培养操作经验 [打印本页]

作者: 4445655 时间: 2011-6-9 12:01 标题: 细胞培养操作经验

细胞培养操作经验

1，注意无菌操作，配制培养液时尤为重要，并过滤除菌，实际上很多情况下生长不良是培养液的问题
2，如果贴壁不好最好用多聚赖氨酸（生长基质）外理培养瓶% w3 G: G; K% p& s( H4 ^
3，细胞种植密度不要太低，因为细胞与细胞之间会发出促进相互生存的生长因子5 _- O) c3 F# V0 {
4，注意及时更换培养液（培养液发黄，或者2-3天）7 F; z; ]3 s1 J6 t: ]5 }
5，传代不要急，待完全长满出现接触性生长抑制后再传代比较好，毕竟那又是另一种环境
6，传代时先用少量培养液先培养3-5小时，然后再补足培养液，这样容易贴壁. W& ~- ^9 D! |: S7 r4 y9 {$ i  o
7，在养来之不易的细胞时，还是用一次性培养瓶为好，国产玻璃瓶实在不敢恭维，在这点上我有惨痛的教训。
8，细胞在新的环境里，初次传代时，最好对半换液，或1/3换液，让它有一个适应过程。
9，我认为，glutamin很重要，培养基在4度中放置2周左右，Glutamin就会降解，所以新解冻的培养基或4度中放置超过2周的培养基中都要补充Glutamin。否则细胞生长受到影响。
10,若细胞不好养，在传代时注意消化液的影响，可考虑消化后用PBS洗涤一次。5 O9 q) a0 Y1 P( Z& h$ a
11，贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基,可能放置几天后颜色变紫.这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时,碳酸氢钠导致了PH值的上升。你可以在使用之前松开瓶口，在CO2培养箱中孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的PH值(确定松开瓶口以保证气体交换).- @% `0 f$ m8 `1 p  V
12,如果细胞培养基偶然被冻,你应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以使用,如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基.
13，当在无血清培养基中添加抗生素时,降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%,血清蛋白会结合和灭活一些抗生素.在无血清培养条件下，抗生素不被灭活.可能对于细胞达到毒性水平.# Z. E( M& E; q4 L, Y8 N  g
14,一旦你在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,你应该在两到三周内使用它.因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解.
15，总之,大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀。将会影响它的性能。$ J) E" P: M/ [& H/ Z
16,在进行传代培养时,我强烈推荐大家进行台盼蓝活性记数.操作者通常通过一个简单的稀释(1:4或1:2)进行传代,不进行活性检测,你可能接种比你认为的低的多的浓度的细胞.这常常可能导致生长缓慢或培养物根本不生长.
17，在溶解的一周内使用贮存在4°C冰箱中的液体胰蛋白酶在4°C就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变的不稳定。
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                           培养基血清浓度8 I1 k" ^( C  g/ z  G  N. J: \

关于血清浓度和是否灭活，取决于您的具体实验，并没有严格的规定。一般原代细胞培养血清浓度稍高，我用20%，有利于提高细胞贴壁成活率，尤其是消化分离后没有培养而直接冻存的细胞复苏，就应该加25%血清。( z3 @/ ?' c9 o) u
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                           污染的处理
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污染现象：' T* A6 d- y" x
细胞培养中的黑色小颗粒，高倍镜下可见活动，大多被细胞盖住，也有附着于细胞表面，消化传代较明显，一般几天内对细胞生长影响不大，培养液不浑浊，可以肯定是支原体污染。因其与细胞竞争营养，长时间对细胞生长有影响。
解决办法：3 `; [' I& K- g/ E
1、扔掉细胞1 {# s" \3 p; T4 G+ x! _  @
2、支原体不耐高温，55度5分钟，45度15~30分钟可干掉它，我试过55度，结果细胞也玩完了。要试此法就看你的细胞能否高温作业了& N$ w% ^  E0 M  p* D
3、支原体无细胞壁，许多抗生素无效。四环素、红霉素也许行，没试过
4、有战友说Tylosin（泰乐菌素 sigma）能行，没试过，准备试
5、M-Plasmocin （Invivogen），看了一下介绍，据说效果很好，晶美有卖，就是有点贵。, E" p$ H# |/ a% N4 x2 J4 o0 A* u
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培养箱的污染：一般与水无关，应该是过滤膜的问题！
前提是水盘中应该在蒸馏水中加入硫酸铜，加量为饱和为止；: O5 F# I, m8 b0 v* Q$ {
具体可参考，培养箱的操作说明！！！！/ k, M- C# l9 g+ q/ S% o, {

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作者: ljs 时间: 2011-6-9 13:12

这个是好东西

作者: maomaoma 时间: 2011-6-9 13:58

楼主总结得好，辛苦了！

作者: xiangchou812 时间: 2011-6-9 15:30

不知大家认同细胞操作经验中的第五条不，“传代不要急，待完全长满出现接触性生长抑制后再传代比较好”。我0-90觉得等到长满了，细胞很容易就会开始老化，出现一些小的颗粒。长到超过90%就可以传代了吧？

作者: franty 时间: 2011-6-10 06:42

回复 xiangchou812 的帖子
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同楼主一样，我的ADSC也很容易就老化，我一般在每隔24h观察细胞时，发现细胞长到80%时，再过24h看时细胞已长满，然后传代。不知道细胞从80%到90%再到长满需要多长时间，也许做个生长曲线能解决问题？

作者: franty 时间: 2011-6-10 06:49

第9条“新解冻的培养基或4度中放置超过2周的培养基中都要补充Glutamin”，请教楼主，对于在4度放置超过2周的D/F12培养基要补充的Glutamin浓度？

作者: shangjianzhong 时间: 2011-6-10 08:58

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作者: luomeiwuhen 时间: 2011-6-19 17:48

顶一个，谢谢！

作者: dandan9230 时间: 2011-6-20 10:18

细胞养着养着就会多一些颗粒，是老了吗？我遇到过，不知道是什么原因

作者: mayuan3012 时间: 2011-6-21 10:12

“10,若细胞不好养，在传代时注意消化液的影响，可考虑消化后用PBS洗涤一次”. q* C$ T# f5 c+ x& Y( D( M' m* v7 ~
消化后细胞都起来了怎么用PBS洗呢？是要离心吗？

作者: cypan 时间: 2011-6-23 10:36

不错，谢谢分享

作者: 琛儿326 时间: 2011-6-29 23:31

回复 mayuan3012 的帖子- [" y0 _! m6 X& h; P' X9 E0 P
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应该是离心后，用PBS重悬细胞，再离心一次

作者: hub12333 时间: 2011-6-30 08:04

回10楼，我的经验是用血清终止消化后，离心，再用PBS混匀，再离心，这样就可以了

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