本帖最后由 细胞海洋 于 2014-10-24 09:51 编辑 9 u# E; G( N4 C7 {+ \ D6 s& W- q% l$ \在此省略实验试剂和仪器设备步骤 ' j- b' P$ r# @7 e* q成纤维细胞的制备 / B) v$ ]( I3 J: b/ a8 a1. 从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies g5 f8 M+ Z; oA 时间：15d 2 }: Q8 \0 |0 [（1） 通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。 7 N7 H/ h1 ?; \# ~) m: }（2） 用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除 5 z5 @# M" k7 j（3） 将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min 9 x# Q% u; W" v) a) [- a. y0 ]! `0 l（4） 另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min + y+ ^+ f8 b! u9 ]' D+ C" S（5） 加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开 {, { x& u# d1 h: z% J. Z（6） Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。0 h4 r; L' V. J1 O
（7） 细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)* q' [0 {2 j( G2 M1 z+ {2 U
（8） 第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。 & A7 h, J% D1 X- K3 j! f（9） 当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and* P, l9 `( h+ O
0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。 * y5 t, Q* g' s( F' u0 u. B, E( m- r% y+ u( `
尾尖（B）时间：10d / \' [5 s! L, k. ?! z3 c! S在此略1 L+ G) B# Z. O" B
解冻 SNL cells TIMING 0.5 h . S1 n; @' Y, h9 X) p7 R（1） 准备9ml的SNL medium于15ml的tube中 ; R. M! w& S. p6 ^. h1 i（2） 从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞） 8 j; W6 O a' b' [8 z* Z（3） 用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）+ T6 A7 m3 ~- C* ~; W' a/ Y$ r! M
（4） 160g 离心5 min，弃上清& l) q' K! C( H1 [5 |' E
（5） 用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO20 c6 Q! b7 b \4 k& t/ e
孵育，直到达到80–90%汇合& O9 I- P3 V) L/ k8 y K8 N; @
7 o4 g$ D. d1 G2 `: d$ B
CRITICAL STEP 不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。 ( k* g1 ^! d* N( ?9 H a1 q7 q7 W1 m, w- f: N1 `6 \% O- l8 z
SNL cells的传代 time：0.5h* F _4 z5 p. H( c
（1） 弃培养液，用PBS清洗细胞一次 ' h/ O+ [* l6 A# x8 } Z& R（2） 吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min 1 O5 E' L! X6 W( m（3） 加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞 * B% ?# I/ Q! H1 h( J（4） 通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage # C5 J- o3 ~5 ?8 i1 C0 _2 n) D5 J& W# B$ ]
Mitomycin C-inactivation of SNL cells TIMING 3 h i+ u d. H% M6 ?
（1） 直接加0.3ml 0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–1" C2 U9 p) w& l
（2） 孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。 u+ g! r3 n/ j+ |- E（3） 吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min ; B" T1 P3 D% p7 O$ b4 J8 I$ P7 k（4） 加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)5 A+ }' V k4 h* d9 y
（5） 细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day. , R% T$ x) X4 T& T% G! SPAUSE POINT ) L# \! D* @! A7 [The mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周" h( w2 y2 S# y+ a) r1 N- _' \1 Z
) M3 t8 p1 L' U+ B
解冻 Plat-E cells TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）4 t$ ]2 B( k( _ e2 Z' G
（1） 准备9ml的FP medium于15ml的tube中2 `' }7 O5 w3 h% M( w
（2） 从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞） 8 J# {* J+ M w4 L（3） 用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1） 7 b) y, U# b6 T# t3 ~5 Y4 r6 _) n（4） 160g 离心5 min，弃上清 6 \# \- E. M+ ?# C+ S0 z! Z（5） 用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育( a5 ]" F, g0 S1 m1 F# d0 z
（6） 第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合) m7 N. M( v) q# @) a
5 z" |0 T& d+ C$ v) ^Plat-E cells传代 TIMING 0.5h " o# g) G% w, q（1） 吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清 4 j( O0 m' U. `6 ~3 J! ^1 c; Z（2） 加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合 a- v. u/ g" ~2 {3 n
Day 1: retrovirus production; Plat-E preparation TIMING 1 h, T8 |! `8 c1 \; u: r( s
（1） 用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min1 ?& y8 l3 [; @* o7 U4 T
（2） 之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S9 C' U3 `! l2 o1 L) C
（3） 180g离心5min3 `, i1 l$ F0 N2 t l! x
（4） 弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮 5 n7 ]. _/ i4 k8 W$ h! G; l& r3 ]& g（5） 细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml ) P/ N% B2 [8 M% w* R（6） Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2 : g; w1 }1 ~7 v' QDay 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells TIMING 1 h2 Z' B" k- U3 N4 a6 N. p
（1） 移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube ' I: b5 A% C3 [- F3 {& q+ M: f4 r（2） 在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min $ g7 h% B6 ~' I, T（3） 加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min" Z/ J* O+ c3 n$ p
（4） 逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜& }' P, \% N/ v' I! U
2 _; |( y) I- @关键步骤 ) ~* B1 R" d. f4 S! dAlso transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction 8 }+ v! |9 E3 \( L4 p7 D- x! r' O2 E
Day 3: retrovirus production (continued) TIMING 0.5 h* @$ c9 F8 L2 U7 C6 c* l
吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator 9 O& _# `2 @) H' Z1 ?Preparation of fibroblasts TIMING 1 h # m2 n7 r q; X# X（1） 培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish） % ~2 H9 A" @, M V（2） 吸出培养基，用10ml的PBS清洗 8 T( B( U' q$ r; u' k（3） 弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min! L, ^& T3 C( {& o2 X
（4） 加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中% X9 H3 S; K, q3 \( V
（5） 细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。 * i. s" X. n5 `; SDay 4: retroviral infection TIMING 0.5 h 2 {2 ^! W; K/ b* ?/ E（1） 用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。 A6 V$ u* o" _" \3 t
（2） 加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–18 q: B- |: O! v* |* w9 C
（3） Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses. - [2 k; B. u6 o1 Z% _# z" N0 w# @关键步骤 0 s6 X; m- B: RRetroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度 ! \* s s \. ?! _: [6 w# `# d( D& w5 J; L
（4） 从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜 % o9 Q2 S$ }3 [3 a; a 1 V! P/ R. b5 vDay 5 and 6 TIMING 5 min each day 5 `) Z+ b9 x# [3 l4 a: a24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS ' k m+ R9 t4 B4 t3 r$ hDay 7 TIMING 5 min! r" J( K6 H5 |, e/ Z9 I3 a
弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G418 " N. M9 H8 j" Q; ~, JDay 8–10 TIMING 5 min each day ! H. P% M3 U: i1 V& E每天更换培养基（分别在24,48,72h后）% \: y! O/ y. S, z! g7 `, S: {
Day 11 TIMING 5 min# z: O7 l1 [3 \
For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–1 " P/ p' S" c% j9 L& |Day 12 TIMING 约5 min each day0 U8 H. W! ]4 Y
每天换液，直至colony becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1） ' P" T- ^7 w# C9 K- x- {Counting the colonies: 结晶紫染色 TIMING 1 d8 B6 u7 W; K6 ~3 R; ^
（1） colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min# m4 {" T" i' X( S; P
（2） Wash the dishes twice with water. 5 S, i$ w2 o2 w2 t# W（3） 加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min+ D [5 [) n3 N
（4） Wash the dishes with water 2 [: U9 u& Y2 U+ V* `（5） Photograph the dishes and count the number of colonies. 5 i" s: K r* F. X& F0 \ : U/ m1 d" j @9 T9 DExpansion of iPS cells TIMING 1 h % R; N0 l: e# f: ^（1） 弃培养基，用1ml PBS清洗细胞" G' B3 e6 N4 U5 B8 S6 B5 c/ h
（2） 彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min' R# A- ]( s( s6 y3 d7 F+ H, c
（3） 加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层, }4 A- O! t8 p" E
（4） 将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2） : n' l1 K$ W3 }9 N1 hPreparation of freeze stock TIMING 1 h5 D& @0 i. x5 I
（1） 弃培养基，用2ml PBS清洗9 W; S- a/ g4 _0 {
（2） 彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min + I- `% y6 I9 q& J9 e（3） 加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层 9 O+ Z+ m3 ~% X3 @, I. L% W, B7 I（4） 将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min + \, N; i2 ]- f$ Q% B2 c" ^（5） 弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml * }2 C e6 @( V2 c% B（6） Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml） " P; t" R9 l1 X( `) R+ ^3 V8 a（7） 加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀 e3 c2 H0 S0 z5 d- f, b（8） Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3） / X2 o" H/ m6 F( L, G: ^8 TPAUSE POINT $ }1 P& T# T# o; g: TFor long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank. . ?, s: }6 |6 J作者: sunny2829 时间: 2011-6-10 09:19
什么时候的呀？？; C5 b7 ?! k6 y r' b 作者: huangcong1988 时间: 2011-6-10 09:29