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标题: WB条带丑陋，求鉴定，求指点，煮样不充分orDNA粘稠？ [打印本页]
作者: 7ubo    时间: 2011-6-13 20:21     标题: WB条带丑陋，求鉴定，求指点，煮样不充分orDNA粘稠？

8.5.jpg 如题，6cm的293T用200ul loading buffer裂解的，煮过以后离心是有沉淀的。

图片附件: 8.5.jpg (2011-6-13 20:20, 127.83 KB) / 下载次数 361
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=Mjg1ODB8MmFlYzQ5ZmJ8MTc5MzQ3MTIzOXww

作者: shuixiao    时间: 2011-6-13 20:26

蛋白浓度过高    每个孔道的上样量不应该超过60ug       过高的话 可能在煮沸的时候出现凝集        建议先定一下量
作者: shuixiao    时间: 2011-6-13 20:27

不知道你是用的什么显色方式？
作者: 7ubo    时间: 2011-6-13 20:41

回复 shuixiao 的帖子# e$ w$ L/ |/ |

& ~3 P9 ~& w! Q+ E- h. v用什么方法定量？BCA？不会很麻烦吗？据说还要先作标准曲线。有没有简单一点的方法？直接测280？我用的是绿色荧光二抗，奥德赛扫膜。
作者: aminhair    时间: 2011-6-13 21:08

定量有专门的试剂盒的。可以方便使用。分光光度计定量偏差会很大。胶是买的还是自己做的？左面的还可以，右面的有点难看哦。电流或者电压调小一点，慢点电泳。
作者: 7ubo    时间: 2011-6-13 21:22

回复 aminhair 的帖子# g- s( ?- N6 k" _$ R8 ^

- P& r7 |- W6 u' a; k8 |谢谢，自己做的
作者: zhenhua    时间: 2011-6-13 21:25

本帖最后由 zhenhua 于 2011-6-13 21:26 编辑
! B& \! }- [, \, V% I2 m9 {4 A* z: O7 t0 B6 g/ {# T8 [, e- K. X
呵呵，怎么能说自己的data很丑陋呢？
* c2 T1 K, [. z) n+ v3 `; n+ T6cm的293T用200ul loading buffer裂解。那你每个泳道上了多少ul呢？
+ c4 V( @0 @  p) X& F3 Z如果不定蛋白量得话，每个泳道上50000-100000个细胞。
" r. z% H: \' |  u9 p- P) N还有，你的样品很黏，条带拖尾，说明有很多DNA，而且DNA没有充分打断。
3 p; ?& y; [+ L- U% j这种情况，我一般要把样品煮20-30min，把DNA都打断了。你也可以试试超声的。& |* M3 ~* O) v" J' A2 E) E, N4 l2 v* a5 q
最简单的方法是，每个泳道上50000-100000个细胞的量，样品煮20-30min.
作者: 7ubo    时间: 2011-6-13 22:09

回复 zhenhua 的帖子: ]# H# K' p* m! [7 H
% ]# F$ L( v) M, d8 u
每个孔上20ul。! c3 s/ G) m' D% w+ h/ w6 u
煮20-30分钟不会使蛋白降解吗？100度吗？
作者: hndxws    时间: 2011-6-14 00:09

本帖最后由 hndxws 于 2011-6-14 00:19 编辑
. o2 g9 W. M1 U) z- P
/ y9 h, K5 a. J  ^. l+ Y我遇见的问题也很郁闷。用的一、二抗体全是昨天的，而且昨天的条带都是好好的，今天跑出来就成这样了。好像显色都反向了，听人说这是因为二抗的HRP太多造成的，也有人说，这是封闭不好造成的。但是我觉得在我的实验里都不存在这些问题。我是用5%脱脂奶粉封闭了一个多小时，而且二抗昨天用没问题，请专家帮分析一下原因，最近这样的情况我遇见好几次了，太郁闷了。

图片附件: [我觉得我的封闭没有问题] 20110612_catenin.jpg (2011-6-14 00:18, 229.89 KB) / 下载次数 356
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=Mjg1ODR8MzQzMjhjNGV8MTc5MzQ3MTIzOXww

作者: 细胞海洋    时间: 2011-6-14 00:29

回复 hndxws 的帖子
: Z' o) Z1 S2 y& A" G% G  O# s! p1 P1 P2 _
建议发新帖提问
作者: 张也行    时间: 2011-6-14 07:59

回复 7ubo 的帖子
$ W( {: ~8 E# a$ u" q
8 ~* K  n* A4 \% A6 s: A直接用280不太准确。BCA其实不是很麻烦的，不到2h就能搞定。
作者: 张也行    时间: 2011-6-14 08:04

回复 hndxws 的帖子
# E7 Y: @* d& h( T4 i$ {7 ~6 ^7 s% @' `
我也赞成不是封闭的问题，毕竟其他地方没有杂带或涂抹啊。但是你的蛋白质弥散了，个人感觉是蛋白质样品有问题，（你加够PMSF了吗？裂解超过1h，还要再加）或者你跑胶的时候电压不稳定，或者转膜的时候温度有点高。
作者: hndxws    时间: 2011-6-14 09:44

回复 张也行 的帖子
1 S3 S: w. X1 Z# I# X1 G) D& f
: p6 h& I4 _  Y* l; }; C) y$ I我的样品和上次的是同一管样品，只是上次的蛋白内参定量差别有点大，想再做一次跑个漂亮的图，所以我觉得也不是蛋白的问题。不知一抗加多了，会不会这样？
作者: shuixiao    时间: 2011-6-14 10:20

回复 7ubo 的帖子
9 {, B7 {3 o' r1 |$ j0 p8 x  U: t# w6 q% C4 c0 D* K; B/ n
BCA 定量就行，不麻烦，有专门的定量剂盒，按照说明做就行。
; i$ D: S+ G1 B( A+ `( [8 Y& {我记得你说过怕上样量少了显不出条带来，一般Western可以检测出ng级别，挺灵敏的。如果真的是表达量很低的话，可以采用胶片曝光的方式显色，自己控制曝光时间，低表达量蛋白延长曝光时间，有同学曾经曝光30min，效果挺不错的。你右边那个图片做的还行，如果下面那条带是内惨的话，好像有点不齐，说明上样量不大一致。
作者: 7ubo    时间: 2011-6-14 14:04

回复 hndxws 的帖子! u* d9 `; e! h8 @; T1 B8 \# e

" n" _. W1 }! M9 m5 i朋友，你的头像是一种带GFP的膜蛋白吗？GPCR？
作者: 张也行    时间: 2011-6-14 14:07

回复 hndxws 的帖子1 O" j, W; G- H: Y! J  x( o2 j
) Y1 y* i: V3 e* C  o
一抗加多的话应该整个片子都有涂抹吧，你这个不是只有条带附近的涂抹吗？
作者: Learner    时间: 2011-6-14 16:10

回复 7ubo 的帖子5 k7 J9 x6 z: F  w$ X7 w0 Z6 G

) k* I: q! O* i4 {, h! G蛋白会变性但不会降解，预防降解可在细胞匀浆时加入蛋白酶抑制剂并在冰上操作。
作者: hndxws    时间: 2011-6-15 11:08

回复 7ubo 的帖子8 S* {1 o  D  Z, @7 _" a+ P5 p% x9 _

( j5 _3 i+ q& u' `) o& n& _带GFP的小鼠囊胚
作者: lifangamanda    时间: 2011-6-15 20:27

zhenhua 发表于 2011-6-13 21:25 ' f. R6 |* [0 _1 I
呵呵，怎么能说自己的data很丑陋呢？
$ W' K5 @  V& P5 m; d6cm的293T用200ul loading buffer裂解。那你每个泳道上了多少ul呢？
- Z% ^1 U: F8 s2 F; | ...

7 @3 A5 e4 o) n3 a请问煮样20-30min，温度？
作者: mayansen1314    时间: 2011-6-15 21:05

我看阁下做得好多了，请问最上边的几个条带是内参么？用的是什么内参？哪个公司买的？你上样上的是细胞蛋白还是组织蛋白？
作者: zhenhua    时间: 2011-6-15 21:29

回复 7ubo 的帖子, W$ h3 y! d" z! l) Z

# d2 |, \! z" a; h& @% c3 {6 B20ul足够。: R" F" @1 [8 _: B  I% W' w2 g
煮20-30分钟不会使蛋白降解。4 i6 j1 t5 y! {/ Y, N
不用离心去沉淀。煮完几乎没有沉淀了。7 G8 X8 d8 w% h0 @5 K9 i0 X; {/ ]1 J
可以用actin等高丰度蛋白试试效果。  n' v7 b  K- X5 G/ C% A* R
作者: lifangamanda    时间: 2011-6-15 21:49

Zhenhua版主，煮样温度，温度？？？谢谢！
作者: wenyangapple    时间: 2011-6-15 23:00

回复 7ubo 的帖子. D3 B) d! H$ M# n) }* ]1 N! k

8 c9 \2 Q. W0 \8 A6 W9 K右侧是好的结果吧？左侧比较糟糕的data最大的可能性没有裂解开，从上面那些黑色的渣滓量比较的大但是下面条带却很细能看出来。裂解buffer的问题可能是pH不对，或者是SDS or NP-40之类的加的不对。
作者: wenyangapple    时间: 2011-6-15 23:01

回复 hndxws 的帖子: K8 {7 g$ O0 O) |' Y

# K  V- {! t/ o/ [0 S' L我觉得你这个是蛋白没有提出来，或者提出来的蛋白降解的比较严重。
作者: pheebs    时间: 2011-6-16 08:45

zhenhua 发表于 2011-6-13 21:25 5 q' w" v) s9 S( @
呵呵，怎么能说自己的data很丑陋呢？
2 @! `9 u& F$ w0 Z" {) y+ |6cm的293T用200ul loading buffer裂解。那你每个泳道上了多少ul呢？) }$ w& N# o/ j, D4 }
...

! b/ g' [- S& r7 i煮这么久，第一次听说。。。
作者: 细胞海洋    时间: 2011-6-16 09:32

回复 lifangamanda 的帖子) T7 E, Y- O& V4 E

- x2 n, h" A1 M( \6 ~4 q& I8 f点击Zhenhua版回复帖中的回复按钮发言 像我这样 否则他不一定会看到
作者: chb611301    时间: 2011-6-16 10:22

我觉得先检查一下配的胶，是不是SDS和Aps的问提，胶凝的情况。其次是样品处理一般都是煮样15vmin，都没有问题了。我们常规经验脱脂牛奶封闭要2小时会比较好一些。二抗稀释浓度一般都是1:5000，到1:8000都可以的。
作者: 7ubo    时间: 2011-6-16 15:46

回复 wenyangapple 的帖子
* [0 ]" z+ Y+ W& i
+ ?: F5 Q; E& W) R- J, R6 S! ~& Q' s长满的6cm的皿的293T用200ul的SDS loading buffer裂解的，是不是加少了？
作者: 7ubo    时间: 2011-6-16 15:47

回复 chb611301 的帖子
- D' H9 H; S9 e' `/ H" z
5 R" L/ Y8 U# c: R6 eAPS少加点是不是比较好？
作者: lifangamanda    时间: 2011-7-6 11:42

回复 细胞海洋 的帖子0 j3 D, V# J. j2 |: l8 `- L' S
' i4 u% S  P! w
多谢海洋哥！



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