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标题: 关于转染问题 [打印本页]

作者: 苏眉1989 时间: 2011-6-25 16:46 标题: 关于转染问题

我记得我们实验室的战友们都说贴壁细胞特别是293T比较好转染，但记得干细胞之家中有人推荐把细胞吹到悬浮时转染，不大明白，特来请教各位高人？另可不可以问下关于那种转染方法适合哪种类型的细胞转染，简单原因，谢谢！

作者: wwy551 时间: 2011-6-25 17:38

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贴壁培养的细胞用离心的方法转染病毒，效率确实比较高。
之前也有人问过ES转染的问题，当时我建议把ES消化成较小的克隆，悬浮转染，因为如果不是用电转而是用病毒转染的话，直接转染贴壁的ES克隆，效率会很低，因为正常生长的ES克隆本身很致密，不利于病毒转染，但是消化成几个细胞的细胞团块的话，相比直接转染贴壁克隆，效率肯定高很多。
你所提到的转染293T就是一般转染贴壁培养的细胞，就这样正常培养状态下加进去病毒和1000×的POLYBRANE，37℃孵育1小时，离心转染90分钟，再37℃孵育一段时间（从加进去病毒转染到换新鲜培养液时间控制在4小时以上）就可以了。

作者: yuyan 时间: 2011-6-25 21:27

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你好！. V! I8 ]8 w% u/ B
请问加入病毒后怎样离心90min？
是要消化到离心管中的吗？用多大转速呢？
谢谢！

作者: wwy551 时间: 2011-6-25 21:59

回复 yuyan 的帖子, H6 p+ `& k2 A% {3 ]7 s" R/ K, a
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用专门能离心细胞培养板的离心机，这个应该很常见的。离心转染的时候就是细胞很自然的贴壁生长在孔板上（六孔板，十二孔板，二十四孔板等各种不同规格），离心之前首先加病毒和1000×POLYBRANE在37℃孵育的时候，培养液体积适当小一点，以便转染的病毒有较高的滴度；离心前补新鲜培养液（比如正常条件下，十二孔板每孔1ML，离心时的体积可以加到2ML），以防离心时，培养板倾斜造成半边贴壁细胞干死。

作者: yuyan 时间: 2011-6-25 22:37

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非常感谢！
应该是离心384孔板的那种大的离心机了。
那么离心过程还需要在细胞房中进行吗？1 a7 Q3 m2 ?5 S8 p2 R) f; H
转速要多大呢？

作者: wwy551 时间: 2011-6-25 23:18

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384孔板？这个还真没见过，我们实验室最多也就用96孔板。离心过程在不在细胞间不重要，当然还是要保证无菌。转速2500RPM，90MIN，33℃。

作者: eley 时间: 2011-6-25 23:21

一般转染的时候不要把细胞给悬浮起来，因为这样也是对细胞的一种伤害，应该把把细胞静置在最佳状态。
如果是使用 Lipo，那就直接按照Protocol上说的就可以，9 l" k" m; W$ }( S. j- O8 ]
如果是钙转，我现在一直使用的是BES，而且我自己的小窍门是就是，在加入质粒之后，不要急于6-8小时换液，而是要往里面加入培液，就是12小时加一次，24小时加一次，然后在进行换液，或者收蛋白。6 y9 {* ^; E e( l! ?4 N
因为细胞是吸收沉淀颗粒，如果换液的话，会把沉淀给吸走，如果只加培液，这样沉淀还在，长出新的细胞还可以继续接受沉淀。所以转染效率高。* L. E, Q: a8 [
希望对你有帮助~~~

作者: wnavy200299 时间: 2011-6-26 00:31

离心转染---第一次听说啊~~~~受教了！
不知效率比普通（正常）转染高多少？或者说高不高？高多少？% |8 s8 u: ? o% X0 _% y
因为效率是第一的，在效率是一致的情况下，过程越简单越好！

作者: huangcong1988 时间: 2011-6-26 09:07

贴壁细胞特别是293T比较好转染？Are u kidding me ?貌似293T贴壁不是很强，而且易成团，虽然293T转染效率是挺高。干细胞之家中有人推荐把细胞吹到悬浮时转染，这个我真不知道怎么说了，因为在做293T转染的时候，一般是贴壁转染，而且之前我做的时候，由于在混匀的时候把细胞摇起来了，效果很不好，所以混匀时摇轻。

作者: aminhair 时间: 2011-6-26 09:20

路过，学到新东西了。

作者: daviddow 时间: 2011-6-26 09:24

293T贴壁转染就是了，那个不是什么技术

作者: yuyan 时间: 2011-6-26 22:35

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好的，非常感谢~~

作者: auguste 时间: 2014-10-11 16:45

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作者: goast8 时间: 2014-11-13 15:54

记得有个病毒转染293t的kit就是悬浮转染。
我在进行大量相同条件孔板转染时，会将细胞消化下来转染再统一种板，这样比较省力，同时更加均匀，转染效率也差不多，

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