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标题: 我要崩溃了，求求高手老师帮帮忙吧 [打印本页]

作者: tk1504008 时间: 2011-6-25 22:07 标题: 我要崩溃了，求求高手老师帮帮忙吧

从3月份开学以来，我养的海马神经细胞就没好过。养到第二天貌似就全部死亡了，显微镜下几乎找不到细胞。% Y; R; j9 U" V' Q+ k4 @
我养的是新生大鼠（24h）的海马神经元，取海马后，剪碎，0.25%胰酶消化20min，含血清培养基终止消化，1000rpm离心10min,弃上清，用无血清培养基+0.2%B27培养，每个皿2ml，24h后全量换液，每隔3天半量换液。! ]) i! Y* b* h' p: i* J7 c
很奇怪的是：在显微镜下看，培养皿底部环境很不干净，细胞周围有很多杂质，形状想很多小黑点，有大有小，不知道这些杂质是什么，是组织碎片？死亡细胞的裂解碎片？还是其他的？而且第一天全量换液后，杂质依然存在，虽然比换液前少了一点，但是还是很多。滤网似乎也滤不掉这些杂质，因为它们比细胞要小很多。杂质多的话细胞死的就很快，而且长得很不好。
求求各位老师高手大牛能不能帮帮我这是为什么？我实在想不出原因了

作者: yxc 时间: 2011-6-25 22:39

1.胰酶消化很关键，最好放进37度细胞孵育厢，终止消化、离心后，一般是将絮状细胞团提出，在另外一个装有无血清培养基的离心管中涮洗一下，再进入第二个无血清培养基的离心管静置5分钟，然后吹散、过筛。3 [5 V+ \' }$ P# K& c" h7 o5 }# a
2.B27对于神经元的存活很重要，一般浓度为2%，即100ml培养液中要有2mlB27添加剂，我们都是买invitrogen的B27，而且要看准类型。( B2 ?/ m. T& {
3.避免污染，甚至添加双抗防患于未然。
再找人分析一下，学习别人怎么做的，自己跟着试试，很快就会成功的。

作者: dingyx2009 时间: 2011-6-25 23:03

我对你的培养方法产生很多疑问：) ?# f! \: j* a) ?% q
1. 不要老看细胞，24-48h是细胞的敏感时期，更不要全量换液。
2. 要想细胞活性更好，换用E17,18天的胚鼠。
3. 无血清培养基+0.2%B27，我觉得B27的浓度太低，调整1%-2%。还有B27有三种，有养干细胞的，胶质细胞的和神经元的，别弄错了。
4. 黑色的杂质多为细胞崩解碎片，多次换液就会更干净了。再者终止消化离心的转数和时间调整一下，我们1000r，5或6分钟就可以完全离心下来。另外，我还怀疑是你消化后，吹打次数太多太猛也会造成杂质过多，并且细胞活性不好。5 A5 X1 Q6 ?+ Z
祝顺利！

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作者: aminhair 时间: 2011-6-26 09:15

我虽然没有做过这个实验，但是我觉的你看的东西还是有点少。- Y# S( D' \" x' |' _9 T' _
对听一听上面两个老师说的话。觉的主要问题还是你培养液的问题。 J& k) Q2 H6 Q3 x% y( W
至于黑的小点，不用管，只要好好操作，按时换液，充分清洗掉死细胞，其实不影响你细胞的。

作者: aminhair 时间: 2011-6-26 09:15

我虽然没有做过这个实验，但是我觉的你看的东西还是有点少。
对听一听上面两个老师说的话。觉的主要问题还是你培养液的问题。
至于黑的小点，不用管，只要好好操作，按时换液，充分清洗掉死细胞，其实不影响你细胞的。

作者: ljzmy82 时间: 2011-6-26 11:03

我个人也认为是培养基有问题，要不重新换下培养基看看结果怎么样？

作者: superlamp 时间: 2011-7-6 16:38

胰酶消化的分寸掌握很重要，注意观察细胞悬液消化时的分层现象，可以加胰酶消化出现第二层后，大约10~15min，再加入DNA酶消化，出现第三层时，共约20min，终止消化。
另外，你的离心速度和时间选择也不好，很容易将细胞离死，从而看到你所说的大量碎片，建议800r/5min。: e; A9 v, y- E+ `
你的培养基成分也不合理，可以加入EGF/Bfgf/LG,帮助分选NSCs

作者: nobelmao 时间: 2011-7-8 14:10

楼上的，看好了人家养的是海马区神经元，用EGF/bFGF养神经干细胞干嘛？- G5 }, v8 \% Z& ]+ J" @
我分过好几次大鼠幼鼠神经元，我的经验是大鼠脑取材后应立即将其放入冰冷的无血清培养基中，并在取海马时应时刻注意应在冰上操作，这点很重要，神经元代谢很快，不降温会死的！还有除了消化以外应全程冰上或四度操作！
消化时我用0.125%的胰酶消化15-20min，记住，之前一定要建成1mm3的小块，这样才能消化开8 a: x" `9 N' s7 f( F/ s
消化后用血清终止消化后再用玻璃吸管吹打把吹打下来的上清移到冰上，其余组织块继续加培养基吹打
最后将总的细胞悬液800rpm离心，铺盘（看到你没提铺盘前有没有多聚赖氨酸coating，如没有一定加上，否侧细胞不会贴壁）
最后想说一句，神经细胞不能增值更新，所以不能像分NSC一样那么粗心，细节上一定注意，稍有不慎前功尽弃

作者: nobelmao 时间: 2011-7-8 14:17

对了还有一些注意的
培养基铺盘培养基DMEM/F12+2%B27+10%FBS 4个小时后换维持培养基就是前面的不加血清，当然用invitrogen的成品培养神经元的更好
细胞铺盘密度一定要大，一个六孔板我铺300万，铺少了细胞之间不能很好的连接不能生存: b W8 y+ I4 |$ n/ l$ F
多聚赖氨酸铺板后一定用PBS洗几遍，过量的多聚赖氨酸对细胞有毒性

作者: liuerfu 时间: 2011-7-10 10:48

黑色的杂质多为细胞崩解碎片，多次换液就会更干净了。再者终止消化离心的转数和时间调整一下，我们1000r，5或6分钟就可以完全离心下来。另外，我还怀疑是你消化后，吹打次数太多太猛也会造成杂质过多，并且细胞活性不好。 I5 Y1 t* @. w4 R
祝顺利！
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我培养的细胞也有小黑点，一直找不到问题。谢谢你的解答6 T0 G% g! U- o' a6 s

作者: liuerfu 时间: 2011-7-10 10:48

黑色的杂质多为细胞崩解碎片，多次换液就会更干净了。再者终止消化离心的转数和时间调整一下，我们1000r，5或6分钟就可以完全离心下来。另外，我还怀疑是你消化后，吹打次数太多太猛也会造成杂质过多，并且细胞活性不好。 I5 Y1 t* @. w4 R
祝顺利！; [3 Z; ~7 c/ j
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我培养的细胞也有小黑点，一直找不到问题。谢谢你的解答5 ? C' f7 S' w4 S: y

作者: liuerfu 时间: 2011-7-10 11:18

1.材料选择。一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA受体。和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。很多人写信问我新生鼠的培养问题，我回答用新生鼠的实验很少，八成是你自己搞错了实验对象，请确认国际上的相关研究文献所用老鼠，再来问我下面的问题。5 p! a: ^  I; C: Y* O/ ^

2，培养基选择（neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。我强烈不建议用血清培养。原因是：

首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量；2 n+ e# W5 Q- e6 `
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其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。严重的毒性会影响许多灵敏实验；

再次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。+ K5 U/ K0 Z; I7 e1 X- H- d) A/ U
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Invitrogen/GIBCO 无血清培养基neurobasal(neurbasal-A)被认为是最标准，最好的培养基。需要的添加剂为 B27和谷氨酰胺。培养出的细胞状态均一，胶质细胞几乎不分裂。其中，neurobasal是胎鼠培养基，而-A为新生鼠培养基。不过根据笔者实验，没什么太大区别，都能很轻松培养成功，但是，切忌中途换培养基，要从一而终。很多实验室是不加抗生素的，也有的实验室加。由于很多初学者操作不熟练，不注意，很多人会污染，所以我还是建议加双抗。
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注意！由于无血清培养基添加剂不是血清，而是人工合成的B27（也有用N2的，但是推荐B27，只差10美金），血清有复杂的解毒作用而B27没有，双抗对细胞的干扰，无血清培养基要大的多。所以，如果你在neurobasal里添加抗生素，记得用量只要标准量的一半。

另一个添加成分谷氨酰胺溶液不稳定，所以每次用时候要现配现加。大概是0.5-2mmol/l大部分人用0.5mmol/l.虽然笔者试过，没加这个也正常生长，但是几乎所有文献都添加，we just simply follow.$ Y: r5 f( z* f
, z; ^9 I) _' ~4 C% T; V4 \3 f

3.解剖过程一定要全程在冰上遇冷。这就意味着，从你处死母鼠后，胎鼠的大脑的温度要最快的降低到0度。另外，在解剖过程中，胎鼠直到皮层或海马被剪碎的过程，有时候可能需要2小时，如果样品多。一定要注意多准备冰袋子。确保你的任何过程都在冰浴的培养液中进行（消化步骤除外）。这样可以大大提高存活率。在解剖大脑时候，有人用hank's，在其中解剖。根据我的经验，即使是0度，神经元还是在进行着很大程度代谢。所以，hanks的无糖环境很不利。我个人建议，用DMEM-高糖或DMEM-F12+马血清来浸泡解剖过程中的大脑，来供给大脑的代谢，血清可以抑制神经凋亡。这其中还有一个问题，就是DMEM培养液会在空气中变碱性。国外有的实验室用L-15培养液来浸泡解剖过程中的脑，因为L-15不会再空气中变碱性。没有L-15的(国内几乎没有），可以全程用DMEM-HG或者DMEM-F12+血清浸泡解剖过程中的脑。注意注意：一切操作都在冰浴的液体中，所以要多准备冰袋。（中途冰袋没了的是猪头）' o) `# p% t8 Y9 o3 ?6 C

4.关于培养皿的问题。一般来说，6孔板是最佳选择。神经元让人苦恼的问题是，神经元发育的情况和密度相关。大于6孔板（比如6CM DISH）会使得中间很难和周围的细胞密度一样，造成板中间和边缘成熟度不一样，而这会给实验带来很大干扰。而太小的话（96孔或128孔）细胞会倾向于向中间集中也会照成发育不均匀。所以笔者经验是6孔板是最佳选择。神经原代培养一定是要包被，用POLY-LYS或者胶原。

关于POLY-LYS包被，我们是包被30分钟，吸干晾过夜，然后洗两次，或者只洗一次但是要30分钟接着晾干。由于neurobasal培养法相当成熟，所以没必要用难固定的胶原。' v- w8 n- X5 p6 D* L5 R3 ]

5.处死母鼠并把胎鼠解剖时候，一定要注意母鼠状态，是否有死胎，胎儿胎盘是不是正常，有多少胎，母鼠是多少天的（一般是E16-E18）这些信息也要严格记录。处死孕鼠后，要立即取出子宫放入冰冷培养液中。注意孕鼠处死后要短暂的浸泡酒精消毒，防止污染。3 N% q1 K5 ~% O; s% M
一般来说，冰袋笔者选择一面蓝一面白的。蓝的朝上，可以很清晰看到海马结构。而去除血管膜的时候，白的那面朝上，这样可以很清楚看到血管膜。
从处死老鼠到大脑被剥离出这段是人就会做，我就不多说了。不过有一点要注意，不管你是用皮层还是海马，不要取一个分离一个，而是要快速把所有胎鼠大脑都迅速取出放到冰预冷的培养液中。我建议胎鼠取出来的时候胎鼠就放在冰冷的缓冲液中。就是说，处死后要迅速把大脑的温度降到0.

6：最影响原代培养的成败因素之一：这小段请大家一定注意看。无论皮层还是海马，上面都是有一层血管膜。注意：一定要尽可能的去掉所有的血管和血管膜。可以用解剖显微镜。胎鼠很好剥离，而新生鼠则比较难。这里千万不能粗心大意！！血管膜没剥离干净的后果是：1 吹打时候很难吹打下来神经元，被迫多次吹打，造成神经元大量死亡；2 血管膜一部分细胞会混入原代培养中，这些细胞往往会分裂，导致你的培养成果根本不能用。可以说，剥离的不好不干净，实验就是失败的，不可能得到高质量的神经元。7 m) E7 L0 C0 A& [, S' ^
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注意的事情二：如果是要的是皮层的神经元原代培养，而皮层的细胞很多，切忌不要放太多皮层消化吹打！过多的细胞反而会导致神经元大量死亡。另外，请仔细注意文献中要的是皮层哪一部位。没有详细要求的话一般是取顶端! {. X7 @; m! \0 W) [  ?/ B$ K
。- j/ ~4 |$ ]8 t$ O& G
从大脑到单个海马的剥离我不细说了。我现在以海马神经元为例。在所有海马都成功剥离后，请仔细的去除血管膜，原因上面说过。最后，请再仔细检查一下是不是都去掉了。确认后，海马片段被移入一个小烧杯里，加少量培养液，用剪刀剪成0.5-1立方毫米的小块，放置冰上准备消化，. x- P6 G# u2 Z" g

7：实验成败的关键之二：消化。一般来说，我看很多人都用0.125%的胰酶消化。实话说，胰酶消化非常的难以掌握速度，而且消化效果真的是--很烂！稍微不注意，就会消化过头，细胞都消化光了。而胰酶消化的快，还会出现细胞快速破裂释放出DNA，和其他蛋白缠结成絮状包裹在组织块外面，使得块里面的不到应有的消化。所以我个人不推荐胰酶。
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想做一个完美成功的消化，我强烈推荐木瓜酶+DNA酶。木瓜酶是消化过后，存活率最高的酶（见附图）。笔者是配成2mg/ml的木瓜酶。另外要用的是DNA酶。DNA酶的作用是，消化掉破裂细胞的DNA，避免了释放的DNA和蛋白缠结在组织块表面而阻碍进一步消化。DNA酶由于各个公司的活性不一样，很难有标准浓度，需要摸条件，不过不是很严格，只要能防止DNA缠结就好。) W" D, W' R. u* s) |1 g: L9 w
木瓜酶的特点是不会消化过头，非常温和。缺点是一定要现配（请直接用无血清的培养液配来保证神经元的营养代谢，而且一定要现用现配。

消化的技巧：消化时候，很多人有不良习惯，喜欢用个50ml试管装着所有东西。结果是组织都沉底，下面消化不足，上面消化的没细胞。笔者的技巧是，用一个6或10CM 培养皿来消化。这样消化液在培养皿里形成浅而广阔的一层，均匀分布着组织块，从而彻底解决了上述问题。消化酶是2mg/ml木瓜蛋白酶+适量DNA酶。木瓜蛋白酶很便宜请放心。消化过程是20-30分钟。由于木瓜蛋白酶温和，因此不会消化过头，使得你的实验消化的很稳定。消化时候请在37度温箱里，每5分钟稍微摇动一下。* r% {: H/ e* a8 `; T
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注意：1）木瓜酶不要用巯基化合物激活，激活后消化好很多但是成活率坏很多；2）尽量用不含血清的培养液来配置木瓜酶而不是用hanks，使得神经元保持营养；3）木瓜酶一定要现用现配。, d  v  }0 k8 F* Z- l" A* R- r
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再次重申：除了消化过程中要37度，其余任何时刻都是要浸泡在0度（冰浴）的液体中。消化过后可以用1ml血清终止反应（我是用马血清，便宜，但是切忌不要用国产血清，污染几率很大）。把消化用的培养皿放在冰上冷却，然后垫高一面使得液体集中在另外一面便于吹打。整个体系静止2-3分钟，然后仔细的去掉上层的液体，保留消化过的组织块  C4 ~1 Z% N4 W) b6 E
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8.实验成败最关键最关键的：吹打。笔者经验是，没有必要用巴斯德管。对于胎鼠和10天之内的新生鼠，一般的1ml蓝枪头就可以达到满意的效果。在一边被垫高的皿里面，加入1-1.5ml新鲜培养基和少量DNA酶，吹打10次。吹打时候要注意，切忌过快，要缓慢吹打。吸入时候要很缓慢，吹出的时候可以略快，但是也要缓慢。轻柔吹打是细胞成活关键！要用进口枪头，国产的有时候会过细。* Y7 x6 h6 g; s
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我们采用的是最合理的分步吹打法。每个10次吹打过后，静止2分钟。这时候游离的单细胞在上面，而团块会沉到下面去。上面的那层就是你要的单个悬浮细胞，把它们挪到指定容器里（一样要冷在冰上）。下面沉淀下去的细胞团块不要丢弃，再加1-1.5ml新鲜培养液，重复刚才的步骤，轻柔吹打，再静止2分钟，转移上层的单细胞到刚才指定容器里，一共这样分步吹打3次。3次之后如果还有团块在下面，请果断丢弃。造成这个的原因就是刚才的血管膜没剥好。这个分步吹打的过程保证了每一个单细胞都避免了过度吹打，而分布吹打又保证了尽可能多的收获单细胞。重申一下，为了保证最大程度收获活细胞，每次吹打之前，可以加入少量DNA酶。这招可以更容易收获大量高质量细胞，尤其是实验材料不足时候。消化和吹打非常忌讳操作的细胞过多，这样反而会使大量细胞死亡。实验者如果是用的皮层这种原材料充足的话，切忌不要放入过多皮层。3 b/ ]8 u" s% C
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9（可选可不选，但是我建议全选）神经元进一步纯化。一般来说，收获的细胞悬液已经是很纯的神经细胞了。但是，由于实验者等个人或者客观原因，血管膜可能不会被完全剥离；杂细胞可能也被吹入了细胞悬液；操作者手法不熟练，造成死细胞过多，影响种板等等原因，还是会影响到培养的神经元的质量。为了克服这些，笔者查了一些文献，经过反复测试采用了nycoprep低转速密度-梯度离心。现在这个梯度溶液已经被公司升级为optiprep.稀释时候，NycoPrep™ 1.077 推荐稀释成 60%，就用刚才悬浮细胞的培养液来配置。注意：1.077被广泛应用于血液中分离血细胞，如果你拿到的nycoprep(optiprep)不是1.077，那么请换算一下稀释度）值得注意的是，皮层和海马可能需要的稀释度稍微有不同。一般来说，一个10ml梯度离心管中，2-4ml稀释过的梯度液体就够用，取决于你收获的细胞量多少。把你收获的细胞悬液小心的加到稀释好的梯度剂的上面一层，经过1500转（不是15000请注意）5-8分钟，神经元被高度压缩到梯度面和上面的培养液分界面那一层。而最下面的梯度剂下的沉淀则是细胞团块，血细胞，杂细胞，以及部分小胶质细胞。而最上层最浮头，则是细胞碎片。这样，你就得到了最大限度去除了杂细胞，和细胞碎片，并去掉了一定的胶质细胞的最干净最纯粹的神经元。如果实验者技术精湛，也可以不用这步，但是用这步会效果更好。注意：母液稀释到60%只是参考，具体实验室不同可能略微有差别，要摸条件而不是死记硬背。另外皮层和海马浓度也稍微有差别。有些文献曾经报道，在梯度一定的情况下，一些特定梯度可以分开神经元和少突和其他胶质细胞，但是笔者从来没成功过。
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10.种板。这一步没有那么非常重要，但是如果没认真弄，浓度的不均一也会使得整个实验失败。记住的是，神经元原代培养是细节决定成败，任何一个环节没处理好，整个实验都会失败。* g4 T/ r" P) x! M3 i1 H
种板密度过低是非常有害的。首先，神经元互相接触的几率小，难以存活和成熟。其次，胶质细胞会大量分裂，导致神经元变得更少，从而得到失败的实验。
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密度过高也是很有害的。由于营养争抢，密度过高有可能导致局部细胞营养枯竭死亡。另外，高密度会导致细胞聚团，结果也是细胞不正常形态或者死亡，导致错误或失败的实验结果。$ j4 {: B/ q+ w# s
笔者的经验是6孔板每一个孔要有7×100000 个正好（如果是台酚蓝染色只记录活细胞，那么酌情减少密度）。注意，注意！！由于神经元的成熟速度和接种密度有很大关系，所以细胞计数一定要非常严肃认真！！！一定要所有格子都看！！如果发现计数板细胞不均匀，宁愿重新计数！！！由于接触抑制现象，适当密度的神经元可以抑制胶质细胞生长，从而达到理想的实验% E$ m2 u- k" Q" k) }4 F$ o' y

由于neurbasal培养液相当昂贵，所以种板时候是不用它的，而第一次换液才用。一般种板时候我们用的是DMEM-HG或者DMEM-F12 +10%马血清。注意一定要进口的。国产杂质很多会导致莫名其妙的细胞死亡。马血清会抑制神经元凋亡并且抑制胶质细胞生长（FBS也可以，但是太贵）- d- j# H6 m! J& y

种板注意事项一：种板时候的溶液推荐使用含有谷氨酸的培养液。神经元的NMDA等谷氨酸毒受体一般3天后才会出现。所以种板时候有谷氨酸不会导致细胞毒性反应。而这时候的谷氨酸反而是有利条件，可以促使神经元贴壁，从而提高存活率。
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注意事项二（严格注意）种板后都是要摇晃板摇匀细胞，切记！千万不能圈圈摇晃！！圈圈摇晃会导致神经元都集中到培养板的孔中间，导致浓度不均，生长不均匀，会直接导致实验失败。正确的摇法是左右平行翻转角度，然后前后平行翻转角度，千万不要让里面液体画圈！2 X  M. Y8 a+ R, S9 ]$ |* F
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注意事项三（严格注意）种板后过过一定时间要换成正常标准培养神经元的neurobasal+b27+谷氨酰胺的无血清培养液。很多paper是1小时就换液，理由是胶质细胞贴壁差，会除去。但是笔者的经验来看，这是极端错误的！1小时换液，神经元还没有完全贴壁，这时候换液会吹下很多神经元，流到孔另外一侧再贴壁，直接照成一个孔内细胞分布不均匀，从而成熟的不均匀。严格来说这种事情直接实验失败。
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笔者的经验是种板4-6小时换液，但是千万不能超过12小时。原因是：超过12小时，混在细胞悬液中的大量细胞碎片也会牢牢贴壁，而细胞碎片直接影响神经元存活和正常代谢；另外12小时后，胶质细胞会开始分裂，这时候就很难抑制了。笔者推荐是4小时，但是别超过8小时。
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注意事项四：4小时后换液时，请轻轻摇晃板几下再换。原因：细胞碎片贴壁很慢而且不牢固，这时候的摇晃可以最大程度去掉细胞碎片。然后，注意：细胞请再用没有加血清的，种板时候用的培养液清洗一次，也是要轻微摇晃，来进一步去除细胞碎片，从而得到良好的细胞生长环境。有条件也可以洗两次，但是笔者觉得一次足够。洗了之后吸干液体，换成neurbasal+B27+谷氨酰胺的神经元专用无血清培养基。! Q; B8 D- C# y! z2 G
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对于原代培养，是细节决定成败，一个地方不够好会满盘皆输，所以请严肃对待。* u" u3 d6 \3 n* j

（德国队的fans于凌晨）0 t- c  y# J3 V/ A+ q7 W6 I
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下面是对版面一些犯错误的研究方法中最严重的错误之一的提醒，请大家注意，我把回帖编辑到这里了。enjoy.

刚回答了一系列形形色色的问题，我把这个问题挑明了说。
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如果您不相信 neurobasal最好的而还是坚持用DMEM之类的培养液，麻烦检查一下你们的DMEM或者MEM或者DMEM-F12的invitrogen产品序列号，到网站上检查下相应的组成公式。很多这种培养液都是含有谷氨酸，而且是mmol级的。# J- G6 L* P9 m7 J4 G& U4 x
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成熟的神经元10um的谷氨酸即可照成细胞凋亡，而谷氨酸受体4-6天就开始表达，如果胎鼠神经元经历了mmol浓度的培养液中的谷氨酸还不被毒死，那就是怪事了。) ]2 r! I7 D$ l
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新生鼠不受这个限制，新生鼠原代培养没有有功能的 NMDA受体，
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最雷到我的，是板上有人用材料非常混乱，一会用胎鼠，一会用新生鼠，一会成年鼠的
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你们这叫对自己不负责任！ we do all cases seriously！而不是凭借肉眼观察和猜测。

做原代培养的，首先就是收集大量背景文献，看看你的相关要求的国际公认的做法是用哪种。胎鼠和新生鼠虽然形状一样，但是神经元的功能一点都不一样，表达受体都不一样。大部分实验都是用胎鼠，而新生鼠往往用来培养测一些LTD之类的（not quite sure,文献太少），所以有人问我新生鼠的问题，我都是说你先看下背景文献是不是你搞错了。

而成年鼠是另外的培养方法，要求更小心仔细和特别的处理。硬套胎鼠的原代培养必然导致失败。3 a  \9 R+ I2 }

另外，在一些药物保护实验中，不要以为NGF就一定对神经有很大作用，笔者的经验是，想要细胞存活，FGF2是最佳选择
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但是，FGF2会导致细胞变化很大，所以还是别用在原代培养中，不过成年鼠培养一定要用FGF2。
对于一些雷到我的，我只能再次说，请收集足够的背景文章在去选择合适材料，please do it carefully and seriously!
祝大家都能培养出健康漂亮的神经元，欢迎大家来问问题（如果是美女的话，给个电话我会很开心）3 O0 r9 v) B0 C2 B0 F7 f

声明，除了最后一幅图是来自别的文献，前面所有的经验都是我的原创，从无数失败总结出的我认为最完美的神经原代培养。; E" w+ n+ w% `( [

最后提醒大家注意：nycoprep(optiprep)可能有很多浓度，但是NycoPrep™ 1.077 以前是最常用的，笔者默认的就是用这个溶液配置的密度梯度。如果您买到的不是这个密度，请换算一下。笔者当时只有NycoPrep™ 1.077在中国能买到，现在可能会有更多浓度供选择，请大家注意换算。
这是我找到别人的，希望对你有帮组

作者: tk1504008 时间: 2011-8-23 17:50

回复 liuerfu 的帖子 a0 s. F. ~. M( N

你好。非常感谢你详细的解答，对我很有帮助。* y+ o* a1 n z: d" }0 h
请问，你说的培养基中最好不要含谷氨酰胺，会引起细胞凋亡，但是新生鼠不受限制，新生鼠元代培养没有有功能的NMDA受体，我不太明白为什么新生鼠元代培养没有有功能的NMDA受体，麻烦您能否解释一下？

作者: tk1504008 时间: 2012-2-22 15:15

回复 nobelmao 的帖子) O- |& y: @2 Y" v: G$ i

非常感谢！

作者: xyybetter 时间: 2012-9-14 16:14

1. P0 ICR小鼠在超净台中，迅速断头、取出大脑，置于装有冰解剖液的无菌培养皿中。
2. 仔细分离出小鼠皮层组织后，用5ml的枪头轻轻吹打5次，转入含有0. 25%胰蛋白酶3 ml的消化液中，置于37℃培养箱消化15min（成年小鼠需要45min）,在此期间每隔5min轻轻摇晃一次。+ q! F( ?0 \' W, g. m
3. 消化完毕后，加入5ml的DMEM完全培养基（含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素）终止消化。: `& q: ] n7 h" i! ~& Z/ K! V
4. 轻轻吹打5次后，1500转离心10min弃上清后，加入DMEM完全培养基5ml，轻轻吹打。0 ~ U& {. f) {) ]5 V3 v
5. 1500转离心10min弃上清后呈混悬液后计数，加入DMEM完全培养基5ml，进行计数后，调整细胞到自己所需的密度。
6. 接种于用多聚赖氨酸包被过的孔板或培养皿中。
7. 置于含95%和5%CO2培养箱，37 ℃培养4 h后，用含有2%B27的neurobasal培养基换液，每隔两天半量换液一次。

作者: xyybetter 时间: 2012-9-14 16:20

使用GIBCO的分子量为150000-300000的多聚赖氨酸，包被5分钟，吸出多聚赖氨酸后，然后吹干，使用PBS洗2次吹干备用。
多聚赖氨酸包被挺重要的，包被不好神经元很难贴壁的。

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