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标题: 求原因。PCR怎么会多跑出一个条带？有图...... [打印本页]

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作者: 熊猫猫    时间: 2011-6-26 20:07     标题: 求原因。PCR怎么会多跑出一个条带？有图......

今天第一次跑PCR，没用内参，只跑了目的基因(217kb)，左边是我跑的结果，为什么会多出一个条带来，而且比目的基因还亮些？
  m) q+ @# Z3 z; [$ k. v还请给位指点啊......

图片附件: Administrator 2011-06-26 13hr 09min11.jpg (2011-6-26 20:06, 6.84 KB) / 下载次数 290
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作者: snickle    时间: 2011-6-26 20:19

建议设一个阴性对照试一下看看

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作者: 殆死悲爱    时间: 2011-6-26 20:40

回复 熊猫猫 的帖子
. N% H9 j; M+ Y2 P0 N0 D4 z# ^( [5 e9 q
非特异性杂带，可能是引物设计的有问题。我只是个人猜测，因为不知道你的模板是啥？

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作者: 熊猫猫    时间: 2011-6-26 21:21

回复 snickle 的帖子
& K: m$ A& X9 J/ y0 Q" t
/ }8 ~5 i. e: k- R1 m  j请问什么是阴性对照呢？

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作者: dulaiyouyu    时间: 2011-6-26 21:27

看来引物没设计好的样子。跑胶还得有个阴性和阳性对照才好啊。。。

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作者: 熊猫猫    时间: 2011-6-26 21:39

回复 dulaiyouyu 的帖子4 H8 K8 U+ U/ @7 s

) s, C3 m$ P3 G4 d9 u: V3 a! j$ p请问什么是阴性对照呢？

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作者: snickle    时间: 2011-6-26 22:03

阴性对照，不加模板，和你的样品一起扩增跑胶

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作者: 熊猫猫    时间: 2011-6-26 22:20

回复 snickle 的帖子$ a2 R5 O% f: ?" g4 o

- A# M! A. t7 B8 V2 X6 F刚才在网上也看了下，不知道对不对5 U3 s7 `# W' M% `% E% t; }& \% Z
阴性对照：逆转录时不加目的RNA，用水代替
3 d$ I, @; `' t6 r( x% t& p阳性对照：逆转录时加目的RNA

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作者: jun8013    时间: 2011-6-26 22:46

引物二聚体？

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作者: jun8013    时间: 2011-6-26 22:46

应该就是引物二聚体

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作者: jun8013    时间: 2011-6-26 22:47

下次做个对照，不加模板，就知道了，你这个应该就是引物二聚体，二聚体大小一般在这附近

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作者: 殆死悲爱    时间: 2011-6-27 09:26

不会是引物二聚体，引物二聚体是最前沿那条带，图中有，只是很淡

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作者: zhangyan813    时间: 2011-6-27 11:38

看你上面的帖子，你这个应该是做的RT-PCR, 你图上这5个泳道是不同的离子浓度吗？
0 F0 R& V" i" f0 D) Q) _! C' A& y建议你做如下实验：1.，下次做PCR的时候建议你在做样品的同时，加一个水对照，就是样品组加DNA, 对照组不加DNA, 用H2O代替，这样就能知道是不是污染了。电泳结果显示如果水对照组没有条带，则进行下面的2；如果水对照组有条带，则说明你做PCR的时候污染了其他DNA，找到污染源，重新做。2. 如果对照组没有条带，而样品组在不同的离子浓度下还出现了这么亮的非特异性杂带，那应该是你的引物设计有问题，建议重新设计一对引物试试。

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作者: pla269    时间: 2011-6-27 12:55

正常有三条带5s、18s、28s，28s为18s的2倍左右，你的图不好说建议在跑一次

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作者: langziforever    时间: 2011-6-28 11:37

首先楼主的问题就不对，这绝对不是多跑出一条带，而是你PCR扩增的问题，另外，你应该是217bp的长度吧？写错了，呵呵！+ \) i1 z9 h$ o3 h* Z( h
另外看你8楼地回复，貌似你做的RT-PCR，如果是这样的话，有多条带也比较正常，毕竟mRNA可能存在多种形式的剪切或者不同转录起始位点，
. b. F+ j1 q9 v5 V4 t$ g5 i建议你优化下引物，或者尝试nest-PCR！

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作者: langziforever    时间: 2011-6-28 11:38

回复 jun8013 的帖子' b% J6 |( a- `3 h" ~
; e. b/ c  f( }5 e8 o
这绝对不会是引物二聚体！

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作者: zxcv12345    时间: 2011-6-28 19:13

回复 熊猫猫 的帖子
, E/ T* T+ f8 B) _( {, y1 {8 d) E4 }/ M" Z7 `( W9 _' R& E
1. 不会是引物二聚体，分子量有点大7 y$ q: Z$ v) n/ k7 V% Q% j
2.应该用blast检测一下引物的特异性， 很可能是引物不特异。

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作者: zxcv12345    时间: 2011-6-28 19:20

回复 熊猫猫 的帖子
/ r; A9 K8 k3 P. c; ~! z- a7 |. t  t, p
1. 不会是引物二聚体，分子量有点大
! q  v3 E! B- ~3 |+ o% o2.应该用blast检测一下引物的特异性， 很可能是引物不特异。

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作者: 熊猫猫    时间: 2011-6-28 21:54

回复 zhangyan813 的帖子
: _5 J+ R1 w& \1 C3 h  h* b# |! K
9 h( F# y) U4 H: W; M! h. l- q- c您好，谢谢您和大家的帮助9 X4 g- g! ~" e( ^* T  v& k9 N
这是我第一次跑RT-PCR，所以这张图上五个泳道的浓度是一样的，只是PCR时的退火温度不一样。6 [* `$ K: [4 a
以前跑过RT-PCR的师兄也觉得是DNA污染，因为引物比对的特异性还是很好的。今天重新RT和PCR了，退火温度设置得要高一些，还是有杂带，只是没上次得亮和明显了。
/ N6 v  Q& l( H; M8 s2 J* L下次就按照你的步骤试试哈，但会不会是在提取RNA的时候就被DNA污染了呢？如果这样的话，有没有办法检测RNA中被DNA污染了？

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作者: daviddow    时间: 2011-6-29 11:26

估计是引物设计的原因。可以P出来不同的基因

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作者: yinjiqingqq    时间: 2011-6-29 17:39

应该是非特异性条带，有可能是你设计的引物或是pcr体系不合适，你可以做Touch-down pcr吧，

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作者: zhangyan813    时间: 2011-7-1 09:56

回复 熊猫猫 的帖子. z, o' R6 q( O& w; Z. M  n

4 X, P& h  Q6 G6 u你们那里有没有DNA和RNA浓度和纯度的仪器，就是紫外分光光度计，提好的RNA可以先上机测一下纯度，要是在2左右就应该很好。要是担心RNA污染DNA的话，可以在提取RNA的过程中加DNase.

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