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标题: 求原因。PCR怎么会多跑出一个条带?有图...... [打印本页]

作者: 熊猫猫    时间: 2011-6-26 20:07     标题: 求原因。PCR怎么会多跑出一个条带?有图......

今天第一次跑PCR,没用内参,只跑了目的基因(217kb),左边是我跑的结果,为什么会多出一个条带来,而且比目的基因还亮些?4 s4 o# f, f! j" s% B
还请给位指点啊......

图片附件: Administrator 2011-06-26 13hr 09min11.jpg (2011-6-26 20:06, 6.84 KB) / 下载次数 220
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作者: snickle    时间: 2011-6-26 20:19

建议设一个阴性对照试一下看看
作者: 殆死悲爱    时间: 2011-6-26 20:40

回复 熊猫猫 的帖子! O" J9 b' y( {2 R7 ]

% d0 A7 ]. U+ [# U! Z# N5 b6 A  ?* Q) k5 \非特异性杂带,可能是引物设计的有问题。我只是个人猜测,因为不知道你的模板是啥?
作者: 熊猫猫    时间: 2011-6-26 21:21

回复 snickle 的帖子
- A5 @6 T$ \3 `" f
$ \5 l; c& ~% h请问什么是阴性对照呢?
作者: dulaiyouyu    时间: 2011-6-26 21:27

看来引物没设计好的样子。跑胶还得有个阴性和阳性对照才好啊。。。
作者: 熊猫猫    时间: 2011-6-26 21:39

回复 dulaiyouyu 的帖子
% I! K( k8 E3 ?: x$ c) V
% i3 p3 |7 X. X7 K请问什么是阴性对照呢?
作者: snickle    时间: 2011-6-26 22:03

阴性对照,不加模板,和你的样品一起扩增跑胶
作者: 熊猫猫    时间: 2011-6-26 22:20

回复 snickle 的帖子  h; y' l% x, Y  E
" n! ]4 e1 a1 z
刚才在网上也看了下,不知道对不对
/ P. |4 h; U7 h( X, x+ H阴性对照:逆转录时不加目的RNA,用水代替
- i7 a9 I3 C$ x6 ~; r' W; g阳性对照:逆转录时加目的RNA
作者: jun8013    时间: 2011-6-26 22:46

引物二聚体?
作者: jun8013    时间: 2011-6-26 22:46

应该就是引物二聚体
作者: jun8013    时间: 2011-6-26 22:47

下次做个对照,不加模板,就知道了,你这个应该就是引物二聚体,二聚体大小一般在这附近
作者: 殆死悲爱    时间: 2011-6-27 09:26

不会是引物二聚体,引物二聚体是最前沿那条带,图中有,只是很淡
作者: zhangyan813    时间: 2011-6-27 11:38

看你上面的帖子,你这个应该是做的RT-PCR, 你图上这5个泳道是不同的离子浓度吗?: y; ]6 `; S$ O% z4 \! F
建议你做如下实验:1.,下次做PCR的时候建议你在做样品的同时,加一个水对照,就是样品组加DNA, 对照组不加DNA, 用H2O代替,这样就能知道是不是污染了。电泳结果显示如果水对照组没有条带,则进行下面的2;如果水对照组有条带,则说明你做PCR的时候污染了其他DNA,找到污染源,重新做。2. 如果对照组没有条带,而样品组在不同的离子浓度下还出现了这么亮的非特异性杂带,那应该是你的引物设计有问题,建议重新设计一对引物试试。
作者: pla269    时间: 2011-6-27 12:55

正常有三条带5s、18s、28s,28s为18s的2倍左右,你的图不好说建议在跑一次
作者: langziforever    时间: 2011-6-28 11:37

首先楼主的问题就不对,这绝对不是多跑出一条带,而是你PCR扩增的问题,另外,你应该是217bp的长度吧?写错了,呵呵!: p! V2 c5 }9 R* g" M3 D& H
另外看你8楼地回复,貌似你做的RT-PCR,如果是这样的话,有多条带也比较正常,毕竟mRNA可能存在多种形式的剪切或者不同转录起始位点,
) W) G) g* l1 r& E  S- C建议你优化下引物,或者尝试nest-PCR!
作者: langziforever    时间: 2011-6-28 11:38

回复 jun8013 的帖子
; N# ?2 j* l9 h& l: b2 |5 T0 L4 H2 y( L+ ]0 |
这绝对不会是引物二聚体!
作者: zxcv12345    时间: 2011-6-28 19:13

回复 熊猫猫 的帖子$ `. m% g" w9 u1 f

% [7 L5 s9 g! G$ |$ Y& b" n1. 不会是引物二聚体,分子量有点大9 H% \& |. v- ?% ~: M
2.应该用blast检测一下引物的特异性, 很可能是引物不特异。
作者: zxcv12345    时间: 2011-6-28 19:20

回复 熊猫猫 的帖子
( A) Y0 \4 D# d; v8 A; y5 g. X* T" [( u6 u6 }% I9 F
1. 不会是引物二聚体,分子量有点大* ^# h: w. z- {! F
2.应该用blast检测一下引物的特异性, 很可能是引物不特异。
作者: 熊猫猫    时间: 2011-6-28 21:54

回复 zhangyan813 的帖子% L4 z  s( D% U' G# Y) X4 }

& L, F8 J, r3 e' Z3 [您好,谢谢您和大家的帮助- l& m+ b8 U) w2 e
这是我第一次跑RT-PCR,所以这张图上五个泳道的浓度是一样的,只是PCR时的退火温度不一样。% M5 }$ m( M0 N$ i; p' S$ N* i3 D
以前跑过RT-PCR的师兄也觉得是DNA污染,因为引物比对的特异性还是很好的。今天重新RT和PCR了,退火温度设置得要高一些,还是有杂带,只是没上次得亮和明显了。
# [' H. @7 d7 d下次就按照你的步骤试试哈,但会不会是在提取RNA的时候就被DNA污染了呢?如果这样的话,有没有办法检测RNA中被DNA污染了?
作者: daviddow    时间: 2011-6-29 11:26

估计是引物设计的原因。可以P出来不同的基因
作者: yinjiqingqq    时间: 2011-6-29 17:39

应该是非特异性条带,有可能是你设计的引物或是pcr体系不合适,你可以做Touch-down pcr吧,
作者: zhangyan813    时间: 2011-7-1 09:56

回复 熊猫猫 的帖子' W+ d: F1 ^  o6 @  R

8 C) O1 A( {  W& |5 I% V你们那里有没有DNA和RNA浓度和纯度的仪器,就是紫外分光光度计,提好的RNA可以先上机测一下纯度,要是在2左右就应该很好。要是担心RNA污染DNA的话,可以在提取RNA的过程中加DNase.




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