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标题: 求原因。PCR怎么会多跑出一个条带？有图...... [打印本页]

作者: 熊猫猫 时间: 2011-6-26 20:07 标题: 求原因。PCR怎么会多跑出一个条带？有图......

今天第一次跑PCR，没用内参，只跑了目的基因(217kb)，左边是我跑的结果，为什么会多出一个条带来，而且比目的基因还亮些？4 s4 o# f, f! j" s% B
还请给位指点啊......

图片附件: Administrator 2011-06-26 13hr 09min11.jpg (2011-6-26 20:06, 6.84 KB) / 下载次数 220
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作者: snickle 时间: 2011-6-26 20:19

建议设一个阴性对照试一下看看

作者: 殆死悲爱 时间: 2011-6-26 20:40

回复熊猫猫的帖子! O" J9 b' y( {2 R7 ]

非特异性杂带，可能是引物设计的有问题。我只是个人猜测，因为不知道你的模板是啥？

作者: 熊猫猫 时间: 2011-6-26 21:21

回复 snickle 的帖子

请问什么是阴性对照呢？

作者: dulaiyouyu 时间: 2011-6-26 21:27

看来引物没设计好的样子。跑胶还得有个阴性和阳性对照才好啊。。。

作者: 熊猫猫 时间: 2011-6-26 21:39

回复 dulaiyouyu 的帖子

请问什么是阴性对照呢？

作者: snickle 时间: 2011-6-26 22:03

阴性对照，不加模板，和你的样品一起扩增跑胶

作者: 熊猫猫 时间: 2011-6-26 22:20

回复 snickle 的帖子 h; y' l% x, Y E
" n! ]4 e1 a1 z
刚才在网上也看了下，不知道对不对
阴性对照：逆转录时不加目的RNA，用水代替
阳性对照：逆转录时加目的RNA

作者: jun8013 时间: 2011-6-26 22:46

引物二聚体？

作者: jun8013 时间: 2011-6-26 22:46

应该就是引物二聚体

作者: jun8013 时间: 2011-6-26 22:47

下次做个对照，不加模板，就知道了，你这个应该就是引物二聚体，二聚体大小一般在这附近

作者: 殆死悲爱 时间: 2011-6-27 09:26

不会是引物二聚体，引物二聚体是最前沿那条带，图中有，只是很淡

作者: zhangyan813 时间: 2011-6-27 11:38

看你上面的帖子，你这个应该是做的RT-PCR, 你图上这5个泳道是不同的离子浓度吗？: y; ]6 `; S$ O% z4 \! F
建议你做如下实验：1.，下次做PCR的时候建议你在做样品的同时，加一个水对照，就是样品组加DNA, 对照组不加DNA, 用H2O代替，这样就能知道是不是污染了。电泳结果显示如果水对照组没有条带，则进行下面的2；如果水对照组有条带，则说明你做PCR的时候污染了其他DNA，找到污染源，重新做。2. 如果对照组没有条带，而样品组在不同的离子浓度下还出现了这么亮的非特异性杂带，那应该是你的引物设计有问题，建议重新设计一对引物试试。

作者: pla269 时间: 2011-6-27 12:55

正常有三条带5s、18s、28s，28s为18s的2倍左右，你的图不好说建议在跑一次

作者: langziforever 时间: 2011-6-28 11:37

首先楼主的问题就不对，这绝对不是多跑出一条带，而是你PCR扩增的问题，另外，你应该是217bp的长度吧？写错了，呵呵！: p! V2 c5 }9 R* g" M3 D& H
另外看你8楼地回复，貌似你做的RT-PCR，如果是这样的话，有多条带也比较正常，毕竟mRNA可能存在多种形式的剪切或者不同转录起始位点，
建议你优化下引物，或者尝试nest-PCR！

作者: langziforever 时间: 2011-6-28 11:38

回复 jun8013 的帖子
4 H2 y( L+ ]0 |
这绝对不会是引物二聚体！

作者: zxcv12345 时间: 2011-6-28 19:13

回复熊猫猫的帖子$ `. m% g" w9 u1 f

1. 不会是引物二聚体，分子量有点大9 H% \& |. v- ?% ~: M
2.应该用blast检测一下引物的特异性，很可能是引物不特异。

作者: zxcv12345 时间: 2011-6-28 19:20

回复熊猫猫的帖子
" [( u6 u6 }% I9 F
1. 不会是引物二聚体，分子量有点大* ^# h: w. z- {! F
2.应该用blast检测一下引物的特异性，很可能是引物不特异。

作者: 熊猫猫 时间: 2011-6-28 21:54

回复 zhangyan813 的帖子% L4 z s( D% U' G# Y) X4 }

您好，谢谢您和大家的帮助- l& m+ b8 U) w2 e
这是我第一次跑RT-PCR，所以这张图上五个泳道的浓度是一样的，只是PCR时的退火温度不一样。% M5 }$ m( M0 N$ i; p' S$ N* i3 D
以前跑过RT-PCR的师兄也觉得是DNA污染，因为引物比对的特异性还是很好的。今天重新RT和PCR了，退火温度设置得要高一些，还是有杂带，只是没上次得亮和明显了。
下次就按照你的步骤试试哈，但会不会是在提取RNA的时候就被DNA污染了呢？如果这样的话，有没有办法检测RNA中被DNA污染了？

作者: daviddow 时间: 2011-6-29 11:26

估计是引物设计的原因。可以P出来不同的基因

作者: yinjiqingqq 时间: 2011-6-29 17:39

应该是非特异性条带，有可能是你设计的引物或是pcr体系不合适，你可以做Touch-down pcr吧，

作者: zhangyan813 时间: 2011-7-1 09:56

回复熊猫猫的帖子' W+ d: F1 ^ o6 @ R

你们那里有没有DNA和RNA浓度和纯度的仪器，就是紫外分光光度计，提好的RNA可以先上机测一下纯度，要是在2左右就应该很好。要是担心RNA污染DNA的话，可以在提取RNA的过程中加DNase.

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