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标题: 试着提了两次大鼠原代BMSC，均以失败告终，前辈们给些建议吧，万分感谢 [打印本页]
作者: taoli10000    时间: 2011-6-29 19:52     标题: 试着提了两次大鼠原代BMSC，均以失败告终，前辈们给些建议吧，万分感谢

提取的是大鼠的BMSC 细胞，腿上的两根骨头都取了，按照别人的一般操作方法进行的，直接用培养基冲洗骨髓，然后两根骨头分装至两个T25的培养瓶，所用的培养基是GIBICO买的低糖的500ml的，然后自己加的血清（10%），双抗（1%），放置三天后，有些是伸展贴壁的非常少，可以数的清，有的是贴壁的细胞都是圆圆的很多，不像是所要的细胞，感觉这些圆的细胞抑制那些伸展开的细胞生长，有些伸展的细胞较多些，呈集落生长，然后堆叠起来，但是总体上数量还是不够多，所有的细胞传代后均是同样的命运：不贴壁啊！传代消化差不多两分钟吧，然后轻敲瓶底，轻轻吹打几次。。。' }/ |2 s: y/ h- ^$ a7 X
由于条件限制，不能拍照，不知道问题到底出在哪里，在这里请教大家，希望给点建议，打算再尝试提取两次，又担心再次重复这样的问题。。。整个操作过程是看过别人有经验的人之后做的，但是就是养不起来啊！
作者: 殆死悲爱    时间: 2011-6-29 20:18

本帖最后由 殆死悲爱 于 2011-6-29 20:19 编辑 1 {  G, [" Y1 h8 U* ?8 s6 U; P
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MSC比较难养，易老化，大鼠的更难。MSC应该是单层梭状，圆形贴壁的细胞应该是造血干。你可以在培养基中加点L-谷氨酰胺，15%FBS试试
作者: wnavy200299    时间: 2011-6-30 09:27

小鼠的更难养啊~~~~~~~~~~8 J7 I: J! x( J+ t4 C7 [
大鼠还好点~听别人说的，呵呵
作者: taoli10000    时间: 2011-6-30 15:58

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嗯，买的培养基里面有谷氨酰胺，但是那个东西很容易降解
作者: taxuewuge    时间: 2011-7-2 23:41

我做的也是大鼠的BMSC，你看一下是不是培养基的PH出问题了。而且培养基放在4度冰箱里谷氨酰胺2周左右就会分解掉，我采用的方法是分装在离心管里然后冻存，用的时候再提前一天解冻。如果有细胞堆叠，很有可能是细胞没有打散，建议先用5ml的注射器打散后再用1ml的打散。本人愚见，仅供参考。
作者: luoziwei    时间: 2011-7-3 11:00

增加骨髓液的密度，或许能行
作者: ivantanqi    时间: 2011-7-4 01:44

殆死悲爱 发表于 2011-6-29 20:18
: K5 k- w+ E1 k回复 taoli10000 的帖子7 q0 I' v7 m- H9 S- i1 _- b

; d7 D8 R- p6 y/ u9 i: P+ G1 r$ iMSC比较难养，易老化，大鼠的更难。MSC应该是单层梭状，圆形贴壁的细胞应该是造 ...

7 L) v: _) m' L, O+ i; c这位兄弟提到的圆形贴壁的细胞是造血干细胞，有什么根据啊？
作者: viv2005    时间: 2011-7-4 10:23

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" I- D3 k+ C1 ?& W1 P0 |请问谷氨酰胺是什么作用呢，倒是在实验室看见有100X的好像，没想到跟MSC还有关系啊
作者: sherolily    时间: 2011-7-4 12:45

谷氨酰胺有利于细胞的生长。在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而逐渐死亡，所以要添加谷氨酰胺，而且，放在4度，两周就分解了，需要重新配制。
作者: 殆死悲爱    时间: 2011-7-4 15:01

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+ w; _8 L$ i' a3 Z+ a3 r
( G8 @+ Q; c& b: h2 V( n( x细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡
作者: 殆死悲爱    时间: 2011-7-4 15:05

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Contamination
+ B  s- Z  A2 U9 ~' ^. a% SHematopoietic lineage cells can contaminate mMSC culture. mMSCs isolated by plastic adherence are heterogeneous and contaminated by hematopoietic cells5 due to the fact that the fraction of hematopoietic cells is higher in both initial and passage cultures of murine marrow cells. mMSCs support the growth and proliferation of hematopoietic cells by secreting growth factors, such as interlukin (IL)-6, IL-7, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14 and IL-15, macrophage-CSF, LIF, FLt-3 ligand and stem cell factor. This problem was solved using frequent medium change that may prevent adherence of many of the non-MSCs and hematopoietic cells to the culture dishes.
作者: cheese    时间: 2011-7-6 19:41

你用多大的大鼠啊，细胞的生长情况和大鼠的生长状态有很大关系。原代细胞是长梭形的怎么会伸展开呢，请问你的是MSC吗？
作者: cheese    时间: 2011-7-6 19:41

你用多大的大鼠啊，细胞的生长情况和大鼠的生长状态有很大关系。原代细胞是长梭形的怎么会伸展开呢，请问你的是MSC吗？
作者: 飞翔的十字架    时间: 2011-7-7 08:57

1. 两根骨头放两个瓶子细胞太稀了
6 F0 l2 F9 s- c% Z2. 你如果感觉杂细胞阻碍MSC的话可以在24小时换液，不过要很轻，防止冲掉贴壁的MSC
4 J3 j4 Z8 F8 ?# @3. 3天后可以用PBS冲洗杂细胞6 A8 }! Z; j# t5 h
4. 建议上图，大家才能看见细胞的样子，给出意见
作者: jiojoo    时间: 2011-7-7 09:13

回复 飞翔的十字架 的帖子% G! {0 Q$ G; K7 _+ l

5 T2 C: T3 T* Q' w/ i' m小弟也在提rat的骨髓干，第一次提，提出来了，后面再提就提不出来了
' d5 l" j% _! x( m提出的细胞都好小啊，好像还没有核
3 E$ K) r% K* D9 D: R; \8 q各位帮忙看一下吧，我这里这几张图片，细胞好纯啊，不知提出来的都是什么细胞/ Z" U, }. k( C1 f: H
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作者: apengforever    时间: 2011-7-7 10:30

两根骨头是可以养两个T25的培养瓶，培养基我原来是GIBICO用的是DMEM/F12，血清首次建议用20%，以后改为10%，双抗看情况加，首次换液在48-72小时左右，首次换液只有少量贴壁，不要急，差不多每三天左右再换液，直到差不多铺满吧，其它就和普通细胞差不多了，那些造血干一般是不贴壁的，贴了也不牢，几次换液，传代什么的慢慢就很少了，可以不考虑。还有注意的就是培养瓶用塑料的，一般就是直接买的CORNING或GREINER的，其它也行，血清我一般用HYCLONE或GIBCO的胎牛血清，要那种好些的，就是一般用于干细胞培养的。我个人感觉大鼠的比小鼠的好养。
作者: jss667795    时间: 2011-7-7 13:05

密度很重要啊，你用2个T25的培养瓶密度太大了吧~！我一般是用T75两个，一到两个T25。
作者: Learner    时间: 2011-7-7 14:48

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9 D* q0 k% u! l* B! p2 S
& L! s: t* X# W我见到坛子里有人将大鼠骨头压碎了培养，不用反复冲洗也有细胞爬出来。你搜一搜看有没有，多试试不同的方法。很抱歉我不是做大鼠的。
作者: taoli10000    时间: 2011-7-7 19:10

回复 Learner 的帖子
6 ]5 g5 T. E( p$ o
$ t4 ~0 L& S6 a; [& n嗯！呵呵，还是非常非常感谢哦！
作者: taoli10000    时间: 2011-7-7 19:14

回复 cheese 的帖子5 a" ]) j4 Y6 m4 V- d2 O

6 ]9 h  ]: ^3 L' k4 N# w9 o嗯，是的，一般都是用6到8周的大鼠。。。
作者: taoli10000    时间: 2011-7-7 19:16

回复 taxuewuge 的帖子
- [  l9 X0 t) F: A% }- L7 }1 L8 o3 a# Y* h
嗯，谢谢，学习了哦！呵呵
. e, C1 L2 k" ^3 h& |  ?3 Q; M
作者: taoli10000    时间: 2011-7-7 19:17

回复 luoziwei 的帖子
3 C3 A! r6 [( d' |0 U1 y5 D
' O! m' Q% h2 X2 p嗯，打算下次提取的时候两根骨头提一瓶T25 的试试! w  g* v+ P: A8 @  x' n3 X* C5 G
作者: taoli10000    时间: 2011-7-7 19:19

回复 飞翔的十字架 的帖子
2 j. o: N/ M- T0 q
/ w9 w, R6 V4 Y. |呵呵呵，没有图啊。。。。打算增加细胞密度看看怎么样。。。
作者: 细胞海洋    时间: 2011-7-7 19:59

回复 jiojoo 的帖子
6 i! `3 B& N: f3 b; i! J! g" I/ [3 I) V9 @. V) Z0 c0 W
建议你发个新帖
作者: lizhiyong    时间: 2011-7-7 22:53

回复 taoli10000 的帖子
# g- s1 p. `% x  n. h8 @" _
4 j5 Q0 ^# u! L5 n你是等于全骨髓培养的；为什么不尝试冲出骨髓液之后，过大鼠淋巴细胞分离液，取单个核细胞，用DMEM+10%血清（我用的是Hyclone公司），大约原代需要8天左右可传代，中途可以半量换液，尽量不要天天关注细胞（因晃动，影响贴壁），双抗加的浓度太高，千分之一至千分之三，足矣；多了不宜。传代消化时间不宜过长，0.5%的胰酶+EDTA，约需3-5分钟，镜下有松动，吹打几下，就会掉下来。圆的细胞可能是巨噬细胞等淋巴细胞，3次传代几乎可以排除（其贴壁较牢固）。希望对你有用。。。
作者: cheese    时间: 2011-7-10 12:05

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- t6 E6 T+ V, P+ p: t7 E, [8 k6 @9 ^7 T* z. S7 j
可以试一下4-6周的，可能会好一些
作者: taoli10000    时间: 2011-7-11 19:55

回复 lizhiyong 的帖子& w# R& K9 M7 C. s7 y
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好的，谢谢，尝试一下吧
作者: 如冰    时间: 2011-7-14 09:48

你好，我培养的是WISTAR大鼠的BMSC，觉得还是比较好养的。想和你分享一点体会：我取的是下肢共四块骨头，每块一瓶，在注意无菌的前提下一定要加快取骨的速度，时间长了细胞的活性会降低。也不知道你用的大鼠是几周的？一般5周左右的各个方面都是比较好的。三天换液的时候细胞量不是很大，但是1周左右可观察到较多的细胞巢，如果细胞局部很密集，可先行原瓶打散，不要急于传代，因为细胞量少的话会影响细胞的生长。您消化的时间可能有点长，消化时要在显微镜下观察，不是一定要消化多少时间，当观察到细胞皱缩快要脱落的时侯就停止就好了，消化时间过长对细胞影响会比较大，甚至会过度消化致死。希望这些体会会对你有所帮助，祝你早日成功！
作者: qiqishichaoren    时间: 2011-7-14 14:37

很奇怪的，我们的是GIBICO  的，上面写着保存在4℃
作者: taoli10000    时间: 2011-7-14 19:26

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培养基一般都是4度保存的，只有里面要加的谷胺酰胺之类的是-20度保存
作者: taoli10000    时间: 2011-7-14 19:26

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( Y. a7 |( g0 ^+ o( C; X, q% {1 M4 n& @7 s" O: b/ [/ B& L3 y
谢谢啊！
作者: 湖南干细胞    时间: 2012-11-5 20:33

回复 sherolily 的帖子0 f. J/ p; M% t4 ]' `) m
" Z% _& I/ Z3 |/ y) m
国外的培养液也要2周添加新的谷氨酰胺吗？



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