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标题: 提总RNA问题 [打印本页]

作者: pla269 时间: 2011-7-1 03:08 标题: 提总RNA问题

在提总RNA的是时候，因为细胞不同加入trizol的量不知道如何估计，大侠们指点一下

作者: lili_19840516 时间: 2011-7-1 08:30

你买的哪个公司的产品，一般说明书上都有推荐浓度，我下载了一个说明书，你看一下

附件: trizol.pdf (2011-7-1 08:28, 183.49 KB) / 下载次数 14
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=Mjk0Nzh8NjNjMDgyNjZ8MTc5MzExNTM3Nnww

作者: langziforever 时间: 2011-7-1 10:17

建议你多加总比少加好，当然如果你们不差钱的话！我们一般用研磨法破细胞后，或者不破细胞直接加，以完全覆盖破碎物为主！因为trizol具有保护RNA的作用，加少了容易引起RNA降解，而多加无害！大不了后面抽提时多一次以去除残留！

作者: hai1986 时间: 2011-7-1 11:29

楼上说的对，trizol量必须足够，否则容易引起RNA降解，提取的效果很差，但多加容易浪费，trizol还是比较贵的。一般根据试剂的说明书添加就可以了，贴壁细胞按培养容器底面积加，每10cm2加1ml trizol，悬浮细胞离心收集后每5-10 × 106加1ml trizol。

作者: mayansen1314 时间: 2011-7-1 11:36

我们实验室用的是Takara的trizol，每5*106个细胞用量1ml，亲手做过，效果可以，个人感觉没有必要那么较真，量充足就好

作者: pla269 时间: 2011-7-1 13:28

如果细胞大小不同，你们是根据平皿大小判断还是细胞数目判断呢

作者: pla269 时间: 2011-7-6 23:50

回复 langziforever 的帖子7 V- r1 M3 v @/ z
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你多加了trizol，那后续其他试剂也按比例增加吗

作者: shuanger 时间: 2011-7-7 10:35

回复 pla269 的帖子; R8 ]8 ]# c3 t( ^ @
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当然！后面要加的氯仿的体积一般为trizol的1/5，体积小了的话会影响上清的量，进而影响你的RNA的产量。

作者: langziforever 时间: 2011-7-7 10:49

回复 pla269 的帖子; i. ~+ I% e/ L' D |/ B
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那倒不用，因为你多加了trizol，后面的液体总体积就增多了，但是你后续操作是要分成小的epp管中进行的，所以，没管还是按照那个比例加就可以了，只是分的管数要多一些！

作者: huangcong1988 时间: 2011-7-7 22:12

trizol一般两到三ml就行了，多了比较费钱，而且提RNA的时候，磨样最好不要磨太多，绿豆粒大就行了，因为加入trizol有限，样太多了，对RNA酶抑制效果就没那么好了，而且磨样其实挺辛苦的，所以磨绿豆粒大就行了，trizol2-3ml就够了

作者: pla269 时间: 2011-7-7 23:43

回复 huangcong1988 的帖子
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你用什么牌子的trizol

作者: amosummer 时间: 2011-7-8 07:49

靠经验的了。也可以来个摸索试验，不同体积试试，哪个效果好。

作者: huangcong1988 时间: 2011-7-8 11:32

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有国内的，也有国外的，国内比较便宜，进口的较贵，但是经验告诉我们，两到三微升足矣，多了浪费，少了又起不到抑制RNA酶活性的效果，无论国内还是进口，都行，两到三毫升，具体特殊情况具体再看，我看看牌子去。。。

作者: huangcong1988 时间: 2011-7-8 11:37

回复 pla269 的帖子0 [5 G: p0 o5 Z$ F) B3 Q- b

Scotland，UK的

作者: endless-caas 时间: 2011-7-8 16:22

回复 huangcong1988 的帖子

交流一下下，你们磨样用的是什么样的棒？是用的一次性的塑料的还是用的电动的铁棒的呢？其实对于磨样，我有时提的时候，就是看的经验，觉得差不多了就行了，但是，可能仅从眼观上看肯定是会有误差的，你们一般是以什么标准呢？磨样加液氮好还是不加好？如果加的话，一定要磨成粉吗？对于磨样过程中样品的飞贱你们怎么看待呢？

作者: huangcong1988 时间: 2011-7-8 20:52

回复 endless-caas 的帖子
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你们磨的是植物组织还是动物组织？我们磨的是动物组织，用的是瓷棒，跟研钵一样的瓷的。

是啊，磨样多少一般都是凭经验，大概可以就行，一般就是绿豆粒那么大就行，其实黄豆粒大也行，主要是加入trizol的量有限，磨太多样不仅浪费体力，trizol对于RNA的抑制作用也不能正常发挥，所以还是尽量不要太多，用肉眼看，一般那个小勺三分之一就够。
磨样肯定是要在液氮中磨的，取出样的时候也要把样放在液氮中，其实比较标准的磨样，整个过程都是在液氮中进行，所以边磨要不断加氮，不要使研钵中的氮干掉，还有开始要加氮到放有研磨棒的研钵中预冷。
这些都是个人经验，你们可以试试
样品最好是磨得细一点比较好，那样提RNA的效果也好一点，而且尽量要缩短时间，因为时间一长，RNA肯定会降解，提的效果肯定受影响。
磨样过程中样品飞溅，如果说样品比较多，溅出去的就不管了，反正提RNA要不了那么多样，如果捡到研钵中会使样品污染，还有就是由于磨样需要很大力气，所以在所难免会使得氮啊，样品粉末啊，混合液啊溅得到处都是，最好在磨样之前在台面上铺几层一次性PE手套，这样使得台面比较干净，而且铺手套有一定缓冲作用，不至于使台面受损。

作者: chliu 时间: 2011-7-9 04:50

我们用invitrogen的，只要少于说明书上的样品的量，一般用1ml。

作者: endless-caas 时间: 2011-7-9 10:58

回复 huangcong1988 的帖子 Q% {8 \4 o* n, m5 J

OK，你的经验给我提供了一定的参考价值。其实我们提的也是动物组织，大小也就像你说的豆粒般大，不过，你们用研钵磨这么小的样，我觉得很厉害。我们时常是直接在1.5的离心管里面磨，但是就是不好做到一边磨一边加液氮，一般也就加一点就磨了，磨完就放冰上。可能还是提得少，所以，我提的结果有时候就是不太好，呵呵，学习了噢！

作者: pla269 时间: 2011-7-9 22:04

回复 huangcong1988 的帖子6 O3 k6 y' M% U) |

提成绿豆粒大，已经不小了，你有什么窍门吗1 u. A& Y' o7 T/ a0 A: b7 k7 z

作者: huangcong1988 时间: 2011-7-9 22:43

回复 pla269 的帖子
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貌似这个没什么窍门，就是磨样呗，多了就少取点，一般样品是足够的，而且比较多，所以磨样的时候如果样品溅出来，没事的，放弃那一点，要不了那么多，主要是样品分开时候比较难，分开之后可以选择性的放弃磨一部分

作者: sdjjfangfang 时间: 2011-7-10 09:50

我们都是将贴壁细胞消化下来，离心，PBS洗涤后添加到TRIZOL，一般T25的小瓶消化下来的细胞就加1ml，效果还可以，提的浓度都还挺高的，纯度也还可以

作者: endless-caas 时间: 2011-7-10 19:08

回复 huangcong1988 的帖子/ H% G. A6 l/ P2 g- j

咦，我弱弱问一下，你们说的绿豆料大小是指的提前的组织的样品大小还是提完后的RNA的大小？我理解huangcong所言应该是指磨完后的样的大小吧？而pla的意思是不是指的提完后的RNA的大小？两者说的似乎不是一回事吧？

作者: huangcong1988 时间: 2011-7-10 21:47

回复 endless-caas 的帖子

恩，我指的就是磨完样的大小，绿豆粒大就够，提完以后绿豆大？他是要提多少？？？trizol是要钱的！

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