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标题: WB实验问题，谁遇到过？ [打印本页]

作者: 龙之吻 时间: 2011-7-3 19:21 标题: WB实验问题，谁遇到过？

大家好，我在做WB实验时无论做什么抗体最好都是两条带，即55和34KD左右，即便内参GAPDH也是如此。在下郁闷之极，大家有遇到过这种问题的吗？怎么回事呢，该怎么解决呢？我样品处理是裂解液裂解，加5*buffer（含b-巯基乙醇，无DTT），煮样5分钟变性，-80°C保存备用。好像不像是降解了。额~~~

作者: boxmanfist 时间: 2011-7-3 19:35

这个问题其实不用苦恼，主要原因是你用的GAPDH抗体除了识别34KD的目标抗体外，还非特异结合55KD的某蛋白，在结果处理时可无视它。如果非要解决这个问题，基本上要换这个内参抗体了。

作者: kjeldahl 时间: 2011-7-3 23:25

呵呵是不是普通的抗体没用单抗，，呵呵呵只要出来就行了。。

作者: mayansen1314 时间: 2011-7-4 08:35

1 会不会是你转膜过程中出现电压不稳，导致蛋白弥散？4 `: {# i; ^' ~' @: S8 N! [
2 你用的抗体是多抗还是单抗，是多抗的话就不足为怪了。
3 请楼主再仔细看一下，你一张膜是不是剪开加了两种抗体，最后曝光出来在一张胶片上，那样的话出现两条就正常了

作者: 龙之吻 时间: 2011-7-5 07:29

回复 boxmanfist 的帖子( U! Z9 j- D1 z+ v( ~# L* n
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先谢谢你的回答。同实验室的做其他肿瘤细胞是一条带。关键是我用同样的样品做别的抗体也是两条带，而且所有显得都是一个位置，而且用的是单抗，所以觉得奇怪呢？

作者: 龙之吻 时间: 2011-7-5 07:30

回复 kjeldahl 的帖子2 j- F6 h; W- ]0 T V3 M& U/ J' |
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额，是单抗是单抗

作者: 龙之吻 时间: 2011-7-5 07:33

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先谢谢哈，前两种情况我已经看过了，没有那种情况。第三种我是分开加的抗体，压片是在一个暗盒里。不过所有杂交的抗体都是在一个位置出现条带，所以百思不得其解。觉得是不是样品二硫键没完全打开呢？

作者: 龙之吻 时间: 2011-7-5 07:44

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第三种情况也不是，我一个膜显一种抗体出现两条带，即55KD\34KD。不同次做的不同抗体也是同样的位置出现两条带，重合性很高。关键抗体是单抗，且分子量是不同的。

作者: 张也行 时间: 2011-7-5 08:57

你去Santa什么做抗体比较好的公司的网站上去查一查，看看他们做的WB得到的结果是什么样子的，说不定正常就是应该有两条带呢。

作者: chb611301 时间: 2011-7-5 10:36

我觉得你是不是应该提高一下封闭液的浓度，用>5%的脱脂牛奶去封闭，封闭时间再长一些，我觉得不是抗体的问题，显影出来的两条带深浅程度如何，都一样深吗我觉得不是抗体的问题，显影出来的两条带深浅程度如何，都一样深吗？

作者: 龙之吻 时间: 2011-7-5 19:14

回复张也行的帖子

恩，看过，说明书也上是一条带。

作者: 龙之吻 时间: 2011-7-5 19:16

回复 chb611301 的帖子

我一直用的10%脱脂奶粉室温封闭2h，有两条带，深浅不一样。55KD明显比34KD条带大，而且34感觉像个椭圆形的黑斑点，不是带状。

作者: 张也行 时间: 2011-7-5 23:33

回复龙之吻的帖子: L1 V' Z, G+ q" O

目的蛋白应该是多大啊？55KD还是34KD？

作者: xxxyzw 时间: 2011-7-6 00:21

考虑一下是否是你的二抗出了问题！
做一个对照，不上一抗，只上二抗，看能否得到同样的2条带的结果，如果是，说明二抗出了问题。

作者: 龙之吻 时间: 2011-7-6 09:35

回复张也行的帖子
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恩恩，我的好了，好像我的loading buffer不行了。后来重新配置的加了DTT后现在显了GAPDH终于对了。谢谢。想问下你知道伯乐半干转对不同分子量的转膜条件吗？

作者: 张也行 时间: 2011-7-6 10:28

回复龙之吻的帖子

不好意思啊，我一直用的都是湿法转膜，所以不太清楚半干法的条件。不过你上网查一下吧，肯定会有很多的。

作者: 龙之吻 时间: 2011-7-6 18:34

回复张也行的帖子- J+ I; o) z& n1 j5 I

，好的，我现在正做半干转和湿转呢。坐下对照吧，湿转效果好但就是耗时。呵呵，O(∩_∩)O谢谢

作者: hxf_86 时间: 2011-7-7 17:37

你这个问题跟我的有点像。% _$ Q- w0 F) w. w8 N0 g N/ j
请问你的抗体是自己做的还是买的商品？有可能是多抗不纯，或者多抗合成的时候特异性不高？

作者: guguai 时间: 2011-7-7 21:23

有时候洗膜的强度不够或者是抗体的浓度过高，包括2抗，会出现这个问题。

作者: jijuling 时间: 2011-7-8 15:25

曾经比较过，RIPA裂解得到的蛋白电泳的背景比较干净，如果直接用loading buffer裂解，背景会比较杂

作者: zxcv12345 时间: 2011-7-11 09:46

回复龙之吻的帖子
+ Q/ e3 R# w; j' n6 k! N: p/ {
可检查下你的电泳缓冲液上样缓冲及配胶缓冲液中有无SDS7 U$ J9 @/ \! J& T/ g2 e. N* @
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你个这问题不是抗体问题，转移问题，
很可能是跑胶的问题2 k! p' v) H! _3 l/ n% S2 N- e
2 F ~' ?: E% c4 ]% }- D
以前一个本科小朋友帮着配跑胶溶液，结果跑胶带型怪异，反复检查后发现是没有加SDS。你可检查有无SDS。

作者: rain2402 时间: 2011-7-12 11:17

我个人觉得，既然是单抗，那你应该多注意封闭时封闭液的浓度及封闭时间，而且也应该加入DTT。

作者: james_0619 时间: 2011-7-20 20:51

个人认为,换掉样品试试,用其他的组织再做一次,排除样品问题;同时换一种封闭液,如低浓度的明胶,我想总是能排除你的问题的

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