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标题: 伯乐Bio-rad的半干转仪，做WB时不同分子量的转膜条件 [打印本页]

作者: 龙之吻 时间: 2011-7-6 09:38 标题: 伯乐Bio-rad的半干转仪，做WB时不同分子量的转膜条件

小弟实验室做WB转膜时是用的Bio-rad的半干转仪，21KD-65KD，我们的转膜条件是12V,15min，可是考马斯亮蓝染胶还发现好多条带，所以特请教大家伯乐半干转不同分子量转膜的时间及电流电压等条件是什么？急求！

作者: guguai 时间: 2011-7-6 13:19

我以前转过50kd的蛋白。$ g5 g" k/ `" q' Q
20v, 2hrs.4 P- y& A8 A) P0 a7 E7 T. c0 H2 M! g
9 W( ~4 v% c- s; P& ~

作者: mayansen1314 时间: 2011-7-6 15:03

我们用得是恒压转，电压电流要跟你的胶，膜面积有关，一般胶面积比较小的话我们用10~15v，时间20~30min，较大膜面积的时候我们用15~25v，转膜时间30min~1h，蛋白分子量大小只要不是非常大（过百）问题都不大。我最近做的wb都用湿转，转膜效率更高些

作者: mayansen1314 时间: 2011-7-6 15:06

还有，转完膜之后的胶染色出现条带很正常，尤其是分子量大的蛋白肯定比分子量小的更难转到膜上。只要你最后一步压片结果好那就好，祝好运。WB这东西很可恶的，我都做了两个月但我这边的条件还是没摸索好，非常不稳定时好时坏的

作者: chb611301 时间: 2011-7-6 15:35

转膜和你配胶的浓度也有关系吧，一般分子量的蛋白基本都是12%的胶，但是如果分子量超过90，甚至更大，肯定胶的浓度要到10%。如果是21-65KD分子量的蛋白用12%的胶时，恒压12-16V ,时间为15MIN-45MIN ,会比较好！

作者: 龙之吻 时间: 2011-7-6 18:38

回复 mayansen1314 的帖子 ~) r( c, M5 J4 ~* h# p) Q) Z% d3 w
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嗯嗯，是呀。现在我延长半干转时间了，15v，30min，转膜效果明显改善了。你说的是，湿转是转的比较好，单就是有点耗时间。呵呵。我做了半年了,WB是不是很稳定，诸多原因都会影响结果。你也好运哈

作者: 龙之吻 时间: 2011-7-6 18:39

回复 chb611301 的帖子; P4 y3 T% n+ \4 d3 l& K" F* g& a

嗯嗯，我现在有的是这个条件，效果不错。

作者: 张也行 时间: 2011-7-6 21:18

回复 mayansen1314 的帖子! w: R( Z9 c3 W0 X" e& d& L& e

我以前都是用湿法转的，还可以。我有一个疑问：为什么要用半干法呢？有什么好处吗？

作者: guguai 时间: 2011-7-6 21:57

还有一种转膜的方法。invitrogen的iblot。6到10分钟就可以了。! B, X; |7 U5 N, ]9 ]2 P
一次可以转两块bio-rad 的mini胶。转完后可以用ponceau S染一下你的膜。看一下转膜的效果。这点很重要。
4 d& T. P' D$ n
其实不管用什么方法转，只要最后western 做出来了就好。

作者: mayansen1314 时间: 2011-7-6 22:03

回复张也行的帖子1 j8 K. f' F- a& V" Q8 `' v: {. ^
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半干转跟湿转都是比较成熟的两种转膜方法，各有千秋。个人认为，时间是两者最大的差别：一般较小蛋白用半干转更方便些，大大节约转膜时间并且能达到满意效果；但是对于较大分子量蛋白，干转的话需要较长时间，这就加大了烧胶的问题，所以一般较大分子蛋白都是湿转，虽然需要更长时间但不会出现烧胶情况。看论坛时有人也用过低压过夜湿转，听说效果也很好，可以想象

作者: hxf_86 时间: 2011-7-7 17:40

我转75KD的蛋白，机器一样，条件是恒压21V，时间我摸索过，低于30min的话大蛋白转不过去的。30-50min就足够了1 f b9 {! t" b. f
另，考染有很多条带不是很好么，说明你的蛋白都转过去了啊

作者: liuerfu 时间: 2011-7-11 11:00

我的是湿转法。恒流200mA，2h转72KD以下的。3h转72KD以上的。

作者: liuerfu 时间: 2011-7-11 11:02

有时连续转了5h还能出条带，并且膜没有转过。（睡过头了

）

作者: cavalieroar 时间: 2011-7-11 12:29

半干转的话，有几点可能会有帮助。1. 使用转膜液先放入冰箱降温。2.考虑到每次转膜的膜大小，膜数量和液体多少都不同，其实每次的条件很难说是一定的，关键在于根据你需要的蛋白大小改变转膜条件。23v 20-25min 可以转大部分的蛋白，恒流的话0.23A，20min的样子，其实膜总面积越大，恒流所需时间就越长。

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