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标题: 跨内含子引物？ [打印本页]

作者: zerollx 时间: 2011-7-8 18:34 标题: 跨内含子引物？

请教大家一个问题啊，什么是跨内含子引物，如何设计之？

作者: jun8013 时间: 2011-7-8 19:16

本帖最后由 jun8013 于 2011-7-8 19:16 编辑
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个人理解，成熟的mRNA不含内含子，而hnRNA是包括内含子的，为加工过的，设计引物时跨内含子，就是你选取设计引物的位点的序列中，是跨过内含子的，防止你在RT-PCR时P出不同的剪接体，对你结果是有影响的

不正确的，欢迎指正

作者: like_gj 时间: 2011-7-8 21:06

跨外显子的上下游引物各自应该落在两个外显子上，这样就是跨过了一个内含子，可以避免基因组的干扰。可以先在UCSC上查一下，确定了每段外显子之后再设计引物

作者: langziforever 时间: 2011-7-8 22:42

回复 zerollx 的帖子 M# W/ p0 f) M# N. e+ s- `

所谓的跨内含子引物，故名思意就是这一对引物跨过一个内含子，我们知道真核生物基因组上的基因是有内含子和外显子组成的，而外显子被内含子说分隔开，但是内含子是不转录成mRNA的。这就是真核细胞内DNA和mRNA的区别，而我们一般用于检测目标基因转录水平时，使用RT-PCR或者realtime PCR，常常需要针对基因设计一对对的引物，一般来讲，在提取RNA的过程中，会带有基因组DNA的污染，所以，对于原核生物必须经过DNase酶消化去除DNA，而真核生物由于内含子的存在，我们可以设计引物分别在相邻的两个外显子上，这样DNA因为引物中间加了一个很大的内含子，而常常无法P出条带或者预计大小的条带，而RNA反转录后的目的条带是我们预期的，这样就可以免去DNA消化的步骤，通过设计这种跨内含子的引物来排除DNA的干扰，但是，并不是每个基因都能找到合适的引物在相邻的且大小合适的外显子上，所以，经常也会在一个外显子上设计引物，这时候就需要完全消化DNA才能得到可靠的结果，不知道我说清楚没有！二楼的说法实在无法认同！

作者: chliu 时间: 2011-7-9 04:40

同意楼上的说法，我的理解也是两个引物设计在内含子两侧的外显子上，可以鉴定PCR扩增时有无基因组DNA污染

作者: jun8013 时间: 2011-7-9 11:35

回复 langziforever 的帖子# {3 Y: M8 {. G- T3 q* b- V& i( b" V% k" Y3 Q

欢迎批评与指正，这个实验我倒是没做过，只是在一篇关于various spliced variants的文章的，选择跨内含子的是避免扩增出基因组DNA及其Pseudogenes，但是选择合适的内含子跨越区，是可以避免不同的剪接体的扩增出来，因为不同的剪接体可能会有不同的效果或者机制。0 l$ s4 I6 r. R; W4 l. p R" b8 B
如果有不正确之处，欢迎指正，本人初学者一个O(∩_∩)O~

作者: 痞子的烟头 时间: 2011-7-10 08:20

设计时，找到CDS区，然后primer，然后找到最合适的引物后，是否跨内含子检测exon，都没问题时，再行blast，检测其特异性，当然如大鼠的不需要检测，可以直接比对；

作者: biocyclin 时间: 2011-9-17 23:35

就是引物跨一个内含子，在P的时候可以防止基因组污染

作者: fearlessman 时间: 2011-9-19 18:37

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作者: xiangchou812 时间: 2011-9-19 19:20

有必要用这种跨内含子的引物吗？由于内含子比较大，所以直接看产物大小就可以得到目的基因（cDNA）了吧。

作者: ghfvcat 时间: 2012-3-20 17:52

http://www.qiagen.com/literature ... Guide_chap_3.pdf#67
最好的跨内含子设计是：一个引物，比如说上游引物，一半位于一个外显子5’末端，一半位于下一个外显子3‘端。这样的引物，可以在退火的时候就排除DNA污染。因为在识别时就是识别的反转的cDNA序列。7 A$ u! Y/ c% Y {. v) W$ P
此外，一对引物分别位于不同的外显子区域，可以从扩增产物的大小上来判断DNA污染。这就是通常说的跨内含子设计。

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