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标题: 经历两次BMSC提取失败后终于看到曙光，在此感谢大家的帮忙！分享一下实验改进 [打印本页]

作者: taoli10000 时间: 2011-7-14 19:38 标题: 经历两次BMSC提取失败后终于看到曙光，在此感谢大家的帮忙！分享一下实验改进

上次发帖求助，多谢各位的建议，终于在这一次提取BMSC看到希望，讲讲我的实验改进吧。。。分享一下，也希望大家给点进一步的建议, D6 {4 z6 H. R% D5 i
1 最初是提取长骨和股骨，每根骨头放T25一瓶，感觉细胞密度太低，然后就改成两根骨头放一瓶，长骨和股骨分开，发现股骨的活性要号很多，密度要大很多，提取的股骨细胞大约5天就长满' a8 ~6 m% H- Y% ?0 x
2 血清浓度由大约10%提高至20%，打算在传代时再用10%，明天看细胞状况，希望它们健健康康
3 考虑到谷氨酰胺的可能影响，在买的GIBCO的培养基中另外又加了1%的谷氨酰胺
4 在配培养基的时候竟然忘记加双抗，不过庆幸的是细胞还好没有染菌。
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目前准备传第二代了，想要确定到底血清还是谷胺胺酰胺有多大影响，希望各位给点建议哦！感觉两根股骨放一瓶T25密度还是挺大的。第一次传代一瓶T25传了一瓶T75，大概三天就可以铺满。。。

呵呵，开心哦！等待准备接下来的实验，希望一切顺利！再次感谢大家喽！

作者: 皮搋子 时间: 2011-7-14 23:54

LZ请考虑一下，三天长满的话是否密度太大？5 N; R8 E+ i+ w

这个时候细胞还未伸展开来，大部分都是圆形。这个时候传代的话细胞状态不好，过了几代就开始老化！

作者: iceyang 时间: 2011-7-15 00:28

养大鼠的BMSC其实不难，我一直就用普通的DMEM+10%FBS+双抗来养，很好，传5-6代没什么问题，一般一只大鼠的2个股骨和2个胫骨接种一个10CM的大皿，2-3天初次换液，6天左右1传2或者1传3

作者: taoli10000 时间: 2011-7-15 08:15

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! V. d) g5 k/ N; d$ @/ E, \/ R8 U
不啦，细胞不是圆形的，应该是P0的时候需要比较长时间，后面的话应该差不多3到4天，早晨刚刚看了，一片一片的漩涡状细胞，完全长满，状态应该没错。嘿嘿，谢谢你的建议，我考虑过，感觉细胞密度确实有点大，我都是1传3，但是又怕1传4养不活。。。

作者: taoli10000 时间: 2011-7-15 08:16

回复 iceyang 的帖子0 d9 D5 f/ d/ j: X* |8 e% C

嗯，养起第一次后面就有信心些啦，打算逐渐放宽条件，让它们在艰苦点的条件下茁壮成长。。嘿嘿

作者: gact 时间: 2011-7-15 11:05

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发贺电，，，B-MSC是mouse的？7 k+ _6 _& x3 z$ t

作者: yishengyouwoly 时间: 2011-7-17 10:15

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# W& m, d. z; I1 B2 g* C* B# Y
恭喜你养这么好，你养的是sd大鼠吗？用的是全骨髓培养法还是密度梯度法？我是用全骨髓法，感觉杂细胞多，而且p2开始细胞形态就不好了。有战友建议用密度梯度离心和GIBICO的血清培养。

作者: 1301918986 时间: 2011-7-19 10:31

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谢谢你的分享，我最近在养兔BMSC，原代总是那么不顺利。看了你的实验下次在改进一下，希望能成功。

作者: taoli10000 时间: 2011-7-20 12:19

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0 V) P. t! I7 G/ m4 `
我用的是SD大鼠全骨髓培养，后面的细胞鉴定还没做的，据我了解一般都是在第四代的时候做流式可以达到百分之九十几了

作者: taoli10000 时间: 2011-7-20 12:20

回复 gact 的帖子, C1 }/ h( `- Z, q" X9 w

Rat的，呵呵, x; c9 v2 R: r! f0 L# x. k) H

作者: jss667795 时间: 2011-7-21 14:56

回复 taoli10000 的帖子8 c5 r2 q7 D# r0 t* h

LZ,血清密度提高后细胞长的如何呢？我也养大鼠的，WISTAR。但是一直养的不太好，怀疑是密度太低。细胞很容易老化。到现在也没养出来，同是新手还希望多多交流哈`！

作者: yishengyouwoly 时间: 2011-7-21 16:02

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p4的时候做流式能达到，90%很难相信呢，之前听同学说，自己养得细胞，分选的时候只有百分之几，我就是自己养得，很受打击。

作者: james_0619 时间: 2011-7-23 08:53

我做的是SD大鼠，取的是股骨，原代还好，长得还行，一传代就不行了，细胞稀稀拉拉的不知道问题出在哪里！我还加了双抗啊( T! a' e c& t4 Z" F# G* R
难道是没加1%的谷氨酰胺？？很希望得到楼主的真传啊

作者: nightvsday 时间: 2011-7-25 15:33

一般我提MSC不需要加双抗的

作者: taxuewuge 时间: 2011-7-27 23:48

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请教你用的老鼠是多重的，年龄是多大的。我养的原代都要长11天才能铺满瓶，而且传到二代细胞就很少了，能分享一下你传代的经验吗？谢谢 K" h. x1 q" l$ y' T! S

作者: taoli10000 时间: 2011-9-14 21:23

回复 james_0619 的帖子0 C5 w- h0 N U: E

首先培养基很关键的是血清要好，国产的太难用，然后培养基要尽量新鲜。如果确定用的试剂没有问题了，就考虑一下消化操作，这个很有影响，消化时间，传代时候的密度等等，慢慢摸索一下，很快就好的。。。自我感觉这个细胞提取还是有点拼几率的。。。

作者: taoli10000 时间: 2011-9-14 21:29

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我用的是6周大地老鼠，你可以尝试一下提高原代提细胞的密度。传代的话和普通细胞的操作差不多，只是时间上要控制好，我一般是加入胰酶之后，轻轻荡一下，差不多10秒之内会看到胰酶的颜色稍微变黄，然后，吸出胰酶，只留下一点点，培养箱中放一分钟，马上拿出在显微镜下观察，此时会有少量细胞漂浮，基本上细胞都变园，然后轻巧培养瓶底部，会看到许多细胞漂浮起来，接着便立即中止消化。这样算下来，整个消化时间大概在两分钟左右，自我感觉每次传代还可以。希望对你有帮助吧

作者: 水兰色 时间: 2011-9-15 08:46

楼主胰酶消化是加EDTA的还是不加的呢？

作者: taoli10000 时间: 2011-9-15 11:53

回复水兰色的帖子& Y( ^2 Q3 y! Y3 _

加了的

作者: chenyuemily 时间: 2011-9-18 16:20

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/ g9 C$ O& U8 N* p ]' t
那消化停止后，还吹打吗？会不会把非MSC一起消化下来啊？

作者: taoli10000 时间: 2011-9-22 19:32

回复 chenyuemily 的帖子- d7 G4 O+ H0 R% x, e
% F5 ?0 t: E* D6 ]
稍微吹几次就可以了

作者: bnm789 时间: 2012-1-15 00:01

回复 iceyang 的帖子0 \" g s- M( w; ~- Y. i5 g1 W

请问你是全骨髓培养吗？第一次换液时是全换吗？用不用PBS洗

作者: lvmaoshiwo 时间: 2012-2-21 14:52

回复 gact 的帖子3 F$ }! j5 V& D+ m& l; f5 N6 o
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你也养mouse的吗？

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