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标题: x-gal染色的假阳性问题 [打印本页]

作者: viv2005 时间: 2011-7-21 09:42 标题: x-gal染色的假阳性问题

最近想看看我的一个转基因老鼠有没有插入lacZ基因，于是收了刚出生的老鼠，做了x-gal的染色，因为不是专门做这个的，所以没有去准备那些菁化物。2%的x-gal是另外一个做突变的试剂盒提供的，我用PBS稀释到了1mg/ml。然后37度孵育过夜，发现有的地方出现了蓝色。
因为没有control，所以我今天又收了1只应该可以算作wildtype的老鼠，做了同样的染色，不到12小时，也出现了蓝色。
我现在想请问的是，大家觉得我这个问题出在哪里？2 u W" B# N0 N
我自己觉得，1，可能是配方的问题，因为所有的protocol都用了菁华物，我不清楚他们的作用是什么，有没有人能解释一下。
2.这个X-gal有问题: {/ C5 k) h. C5 n
3.x-gal染色的假阳性率高么3 _+ Z* W# R$ v5 D9 A. z
4.我的wildtype的老鼠genotype出了问题。& g8 R: f3 O# ?) i0 I, v
请大家不吝赐教，多谢

作者: viv2005 时间: 2011-7-21 23:41

nobody knows? Oh, my god! What can I do next

作者: shen_coco 时间: 2011-7-22 20:04

我只用过专门的染色试剂染的，是碧云天公司的，从没出现过假阳性，没用过你的方法。

作者: seanboy 时间: 2011-7-24 11:43

X-gal的假阳性绝大部分都是和pH值相关的。你可以查一下资料。我记得是偏酸的情况下，WT且没有senescence的细胞也能染上蓝色的。所以一定要调准pH值，且每次实验都要有足够的control。

作者: viv2005 时间: 2011-7-25 00:54

回复 seanboy 的帖子
1 w8 ?# \) t/ j0 w: j% P5 E
非常感谢你啊，那到底PH值低到什么值就会假阳性呢，我用的7.4的PBS稀释的X-gal。文献上好像说不能超过8.0，有点疑惑了，难道要用8.0的tris缓冲液试试

作者: sylar.wy 时间: 2011-8-6 09:18

X-GAL假阳性很高吧- - 我做酵母双杂时染色都可以忽略这步了。。# @+ l5 G! ^" B$ p; y x
还是后续的验证重要

作者: franklinhg 时间: 2011-8-15 10:49

一直都不高的假阳性率啊其实很简单 A kit 里的试剂你非要拿到B kit 去用？难道人家公司是傻子，会砸自己的招牌？明明一个试剂盒就可以的人家非要给分成2个卖给你？不要想当然的改变试剂盒的配伍，那会让你的试验拖很久的。

作者: wang3033 时间: 2011-8-15 22:43

x-GAL反应应该在8h以内，超过8小时，应该视为非特异性反应。

作者: franklinhg 时间: 2011-9-9 13:16

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+ z2 }" A' e# \1 M- u( ]
实验试剂盒不一样那么孵育时间就不一样对结果的判断也不一样。
我用的实验试剂盒推荐是在20分钟到16个小时内染上色的都算是阳性结果。
X-gal染色和PH有关主要是在配置染色液时候的PH和孵育时候的PH值。染色液PH一定要准确，孵育时候在一般的37度的微生物培养箱避光孵育就可以了，不用在细胞培养箱去了，因为其中的CO2会影响染色液的PH值的。

作者: hnczlw48005 时间: 2011-9-9 15:48

首先染色时间过长会产生一些背景。其次应仔细查看染色的地方，依我的经验x-gal最容易在肠胃组织着色。开始一直不明白因为目的基因不在此处表达，后来经过思考终于想通，x-gal染色原理是因为lac-Z酶的催化作用，所以着色代表检测到了lac-Z酶的活性，那是否是你转的基因表达的结果？我们知道许多细菌体内含有这种酶，所以如果有细菌出现也可能引起着色，肠胃组织中有大量细菌存在故很容易染色。

作者: viv2005 时间: 2011-9-10 12:35

回复 hnczlw48005 的帖子* q5 W& W# c' r- C$ ]5 b

谢谢回复，我一般是用的尾巴尖或者是爪子，自己颜色比较浅，这样有变化看起来比较明显。我后来试了下用Tris-cl 7.4的缓冲体系，没有着染了，但是现在的问题是我并不知道我们的老鼠有没有LacZ基因，所以没有阳性对照，也不知道到底是Tris不行，还是没有

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