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标题: MEF是先铺后灭活好还是先灭活后铺好？ [打印本页]

作者: dilal 时间: 2011-7-22 13:17 标题: MEF是先铺后灭活好还是先灭活后铺好？

MEF作为饲养层是先铺板待长到一定密度再用丝裂霉素灭活好？还是先用丝裂霉素灭活后一定密度铺板好？
个人认为，两者都有利弊。前者对于细胞状态的可控性比较好，可以选择细胞状态好的细胞进行灭活，但是不易控制MEF的铺板密度；后者灭活后消化铺板，细胞状态可能会出现波动（消化过程中的各种因素），但对于MEF的铺板密度易于控制。
不知道各位采用的是那种方法，欢迎大家讨论各自的利弊！

作者: christophe 时间: 2011-7-22 13:21

回复 dilal 的帖子7 P4 E. c/ E4 z6 c6 _' @5 {: n1 s

我是用的后一种方法，每次处理一大批，计数冻存，然后用的时候提前一天复苏就可以，感觉对细胞状态影响也不是太大。前一种方法每次用都要提前处理，比较麻烦。

作者: yangpan521 时间: 2011-7-22 13:38

楼上朋友想问问你，饲养层细胞可移冻存吗，我的做法是先用先处理，不太明白这两种有何区别，

作者: christophe 时间: 2011-7-22 15:01

回复 yangpan521 的帖子" ~' v% L: u2 w1 K% z" d5 R* N2 k
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可以冻存的，用丝裂霉素C处理完之后正常消化冻存，细胞只是没有增殖能力了，但还是活的，所以解冻之后再用是没问题的。

作者: lemma710 时间: 2011-7-22 15:44

我也是用后一种方法的，灭活以后，计数冻起来，要用的时候再复苏。1 X* ~3 B; f8 ~
但是你要提前试一下你的培养皿或者培养瓶用多少数量处理过的MEF密度比较合适，以后就可以一直用这个密度了。

作者: dilal 时间: 2011-7-22 17:02

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我师兄也说是要现用现处理，说是冻存以后细胞状态会不好，但是查看了很多干细胞培养手册都是处理后再铺板，多余细胞冻存。1 Q5 @9 ? w* M+ p
个人觉得现用现处理的话工作量太大了，做一个原代多次传代以后是可以得到大量的细胞的，远远超过了ESC培养所需要的细胞量。多余的细胞不冻存的话实在是浪费，孕鼠死的都有点怨。另外，MEF用于feeder以第三代细胞最好，最好不要超过6代，如果现用现处理的话，缩短了原代使用的期限。

作者: yangpan521 时间: 2011-7-22 19:51

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有没有比较过解冻的饲养层与现铺的区别大吗，解冻的有没有漂很多死细胞

作者: 懵懂干细胞 时间: 2011-7-23 13:25

我一般是在P2-P3代把细胞用丝裂霉素处理之后再冻存，然后再复苏出来做饲养层，
考虑周到一点的话，可以在P1-P2代就不用丝裂霉素处理冻存一批，等要用的时候可以; ]0 W+ y# S3 R9 X# P
复苏出来，传一代再现处理现用，这样就可以有足够的MEF细胞用，也不会纠结冻存前处理还是冻存后处理。& i6 R# P3 O3 k: i W5 k) Q4 a3 Z1 p

作者: dilal 时间: 2011-7-23 13:27

回复懵懂干细胞的帖子

谢谢，不错的方法，借鉴一下

作者: christophe 时间: 2011-7-23 16:36

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3 C( T. f+ i; U! z- c
区别不大，基本上死的很少。

作者: dongxin 时间: 2011-7-26 11:04

我们采用后者，效果还是很不错的！

作者: liuyunhui2004 时间: 2011-7-26 15:13

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和我们用的方法一样

作者: ldy689689 时间: 2011-10-25 19:38

我用的是后者，但是有一次我没有处理冷冻过的了，就现用现处理了几板，结果与冷冻的效果一样。

作者: tigerfish 时间: 2011-11-9 09:31

常用的程序是灭活后冻存，使用的时候再解冻铺出来

作者: majing217 时间: 2011-11-9 10:31

先处理，然后冻存，用时在复苏。

作者: varing 时间: 2011-11-9 10:40

两种都有优缺点：
丝裂霉素处理后冻存，复苏后细胞一般会死很多，没有不处理直接冻存的复苏效率高，优点是取出后复苏好就可以铺板用；* F, q. k/ u; G8 p2 `9 l
先冻存再处理的话，复苏效率高，但每次都要用撕裂霉素处理一次，而且复苏后一般会有一代左右的传代操作，等于细胞传代数又多了。5 {/ `' ^ m# l4 C/ ?
本人倾向于第二种方法。虽然传代数多点但细胞数目密度能保证。

作者: dilal 时间: 2011-11-11 20:20

回复 varing 的帖子
, H3 ]1 ?' j, v: Q& B
分析很到位，的确是

作者: bobo198666 时间: 2011-11-14 15:04

一般是P2代处理，长到80%左右用10ug/ml丝裂霉素处理3个小时，冻之前一定要用PBS洗干净，4遍，否则残余的丝裂霉素对之后实验影响很大

作者: 准姿梅影 时间: 2011-11-21 22:23

我一般用P5的MEF，现处理，工作量是比较大，但是可以通过解冻细胞的状态判断饲养层的好坏。大批量处理再冻的方法也可以，不过要考虑处理后细胞在解冻后是不是利于ES细胞的生长，各有利弊吧

作者: houbara 时间: 2011-12-19 12:53

either way, it depends on your experince. If your feeder cells is established cell line, such as STO, frozen mitomycin C inactivated cells is more convinient. and assure the repeatbility of your result." O& s8 m" a0 C/ g% j
But it always better to do a couple of times trials, and work out your working protocols.

作者: cortex 时间: 2011-12-20 09:50

大多数人会采用，处理一批，冻存，用时解冻，这样相对比较方便。当然先用现处理，状态要好一些。不过，如果细胞冻存处理的好，影响倒不是太大。至于楼主的问题，你确实不好保证你要的饲养层浓度。再者，这样可要好好洗洗细胞啊！

作者: bigsnow55 时间: 2011-12-20 22:41

christophe 发表于 2011-7-22 13:21 ; D, m" J4 _8 ^7 _0 @4 B
回复 dilal 的帖子5 n0 T; \& d8 E2 x0 E( w

. Y: l- k5 Q. p' M我是用的后一种方法，每次处理一大批，计数冻存，然后用的时候提前一天复苏就可以，感觉 ...

4 w# o$ K! ?/ m) r& a$ q2 t; ^
学习到了很多，我以前都是现用现处理，然后传一代，感觉很辛苦。# V, C. P: N8 P
请问你们每管冻存MEF的数量是多少，种于多大的培养皿，冻存液的体积大概是多少，谢谢！
因为我想，如果是60mm培养皿，需要MEF细胞42X10000个，是否每管就冻这么多个细胞，还是考虑到复苏时有些细胞会死亡，冻存数量稍微多一点？

作者: lindan666666 时间: 2011-12-27 16:17

我们也是先丝裂霉素处理一大批，计数冻存，然后用的时候提前一天复苏就可以，死细胞很少，接种的ES细胞状体很好哦

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