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标题: 求教 群友高手 [打印本页]

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作者: fwyou    时间: 2011-8-1 21:15     标题: 求教 群友高手

想请教一个问题，为了正确评估qPCR的扩增效率，至少三个重复？您们一般做几个、四个？还是？

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作者: linlicau    时间: 2011-8-1 21:20

fwyou 发表于 2011-8-1 21:15
8 E; A- g9 D. [* Z想请教一个问题，为了正确评估qPCR的扩增效率，至少三个重复？您们一般做几个、四个？还是？

' Q3 r5 Q/ E* I
什么叫扩增效率？
9 y: M, q( b$ s- e' \
% H2 ~, V# M/ G+ v在做qPCR是要先test你的qPCR引物，看其是否特异。也就是在对照组（加水）和实验组中（一般每组3个重复即可。）先test一下引物，看峰是否单一，C（t）值是否合适（如果此值在实验组中为35以上，要么说明引物扩增效率不好，要么说明此基因表达量很低。）。对照组水中的C（t）值应该为N/A，或者在38以上为好。

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作者: johnnymmzhrt    时间: 2011-8-1 21:36

回复 fwyou 的帖子" V# I( [7 K( R2 p& n$ g

" O4 ~& p6 k% [- o- o你是要评估引物的效率还是别的什么？如果是引物效率的话一般三到四个重复就可以了
4 g$ O8 z5 m% }" K) w! r但是貌似扩增效率这个东西很难评估的吧 不同的引物 不同的模板 不同的缓冲液配比都不一样 甚至连不同仪器之间都会有差别的吧。。。

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作者: fwyou    时间: 2011-8-1 23:58

呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个重复是在96孔板一起做完还是独立分三次去做。。。。！1 Z5 F+ N1 s& k
每次做都有对照 还是就检测好引物之后就不用对照，阳性对照你们用的是质粒？？
5 s( ?2 w! ], B* X# h' j# }
2 v, B1 W3 D* W4 _% x谢谢啊

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作者: fwyou    时间: 2011-8-1 23:58

回复 linlicau 的帖子
) b) _/ [' K2 q- q- ^* t: }& P+ @$ ?( q* S1 e
呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个重复是在96孔板一起做完还是独立分三次去做。。。。！& A/ P. B4 c) v% i  x" l6 f
每次做都有对照 还是就检测好引物之后就不用对照，阳性对照你们用的是质粒？？
$ @7 l: I; ~# s6 s. `% q* w+ C3 u9 l
0 t: D& C, n' |3 j8 |谢谢啊

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作者: fwyou    时间: 2011-8-1 23:59

对了 模板还做梯度稀释吗？

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作者: linlicau    时间: 2011-8-2 08:56


  M+ D6 \1 P3 D4 e" E

fwyou 发表于 2011-8-1 23:58 $ g4 r0 L: x, Z% H# f$ `( U
回复 linlicau 的帖子- x. M5 _  f' {
. C6 s% w) T8 [1 x/ ]1 H
呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个 ...

9 C( }- Y, D: W7 g+ Y2 T1 g! D, d
9 `0 B8 u* B# |% y" F) E$ {同学，可能是我没有说清楚。我再详细说一次吧。
5 `$ U: B  J' O9 C1 B2 i1 r" B
, }7 @5 N2 t: s% u1 V5 U8 a$ c# b在真正的用qPCR做基因表达检测前，需要对用于检测该基因的引物进行测试，测试的目的主要是看此引物是否特异（特异的意思就是只能PCR出你要的基因中的片段，而不是其他基因中的片段），" m& E2 K/ Z4 u! |2 [

  R$ ^, T5 K2 l) V) w  i" a特异的检测标准一般就是：你做两个组，一个是水空白对照组，即：其他成分加的都一样，只是template只加水，三个重复即可；另一组是实验组，也就是template加入的是应该包含你需要检测基因的cDNA, 三个重复即可。是不是特异就看：加水的组本应该没有检测到任何的表达，C(t)值应为N/A；而实验组应该有表达，并且你在看melting curve的时候应该是单峰，没有别的偏峰。且最好实验组的表达的C(t)值应该在35以下。然后，等realtime PCR做完，最好跑个gel验证一下，是否实验组只有一条带，且这条带的大小应该与你设计的大小一样，比如200bp（一般realtime PCR片段长度为100-300bp）。
; }, T' `$ b$ U' n
! G8 |9 A2 R' Y$ Q" h如果这些都ok了，那么你就可以做你自己的实验了。
+ r; H4 @, }) J. f* u7 ^) B3 ~3 O; v& _( j
在做你自己的实验检测某个基因表达情况时，最好每个样品做三个重复，并且同时要做ACTIN或者GAPDH作为reference，最后要对通过实验组对这些reference基因normalize之后得到你要的相对表达值。你就可以看到在不同组织或者不同时间你的基因的表达情况。

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作者: fwyou    时间: 2011-8-2 09:55

回复 linlicau 的帖子
' D* b. y7 g) H% U* F6 B8 Q6 t4 s% B! w6 d) y+ A
非常感谢 。。。。

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作者: echowdk    时间: 2011-10-12 11:28

回复 fwyou 的帖子
8 P- \9 V" |0 B0 u" T- h
- a4 k. ^! t3 h在检测引物的扩增效率时，所用模板是需要稀释的。我们实验室一般是做四个梯度，4倍、4倍的稀释，即：1、1/4、1/16、1/64。

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作者: mansnoopy    时间: 2012-1-13 12:50

我们一般是复孔3个，然后整个实验重复三次

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