干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: 为什么小鼠胚胎干细胞培养过程中成团漂浮？ [打印本页]

作者: dilal 时间: 2011-8-4 17:37 标题: 为什么小鼠胚胎干细胞培养过程中成团漂浮？

最近一段时间，mESC培养过程中多次出现细胞成团的漂浮现象。我用的是CGR8系的小鼠胚胎干细胞，饲养层是自己原代提取的MEF（昆明小鼠孕鼠），培养基成分为：85%knockout DMEM+15%KSR+1%NEAA+1%GlutaMAX+0.1mMβ-巯基丙醇，培养时加入1000U/ml 的LIF。起初怀疑是饲养层的问题，所以采用了无饲养层培养方法（明胶铺板）。把复苏的细胞分成三瓶，一瓶feeder+KSR培养基；一瓶feeder-free+KSR培养基；一瓶feeder-free+FBS培养基（80%knockout DMEM+20%FBS（Gibco）+1%NEAA+1%GlutaMAX+0.1mMβ-巯基丙醇）。( Z$ j* I" M6 q* c  d" K# h
复苏后第一天：feeder+KSR培养基：mESC贴壁可，漂浮细胞较少，10倍镜下可见很小的细胞集落，细胞状态可；4 L* x6 V4 W$ w6 |! X& x, k' a
            feeder-free+KSR培养基：mESC贴壁差，漂浮细胞较多，贴壁的细胞多呈圆形，折光性差，感觉细胞缺乏活性；0 F, ]+ H/ l  ]0 N
            feeder-free+FBS培养基：mESC贴壁好，漂浮细胞不多，细胞集落较大，贴壁的细胞呈圆形、条形，许多细胞出现了分叉（感觉有所分化）。
复苏后第三天：feeder+KSR培养基：mESC出现大量漂浮细胞，漂浮细胞成团（偏黄），贴壁的细胞集落生长缓慢，而且边缘界限不清，feeder状态也欠佳，高倍镜下可见许多的黑色颗粒；
            feeder-free+KSR培养基：mESC同样出现大量成团漂浮的细胞，贴壁的细胞多呈圆形，未见生长，折光性差，细胞状态很差；$ ~1 \2 {0 V( n, ?8 _1 b" h
            feeder-free+FBS培养基：mESC漂浮细胞不多，细胞集落明显增大，分叉的细胞集落明显增加，分化比较严重，但未见有成团漂浮的细胞。
不禁产生以下疑问：1、为啥KSR培养基培养的mESC在复苏第三天都出现细胞成团漂浮的现象？是否跟KSR有关？+ E9 a- f. a3 H
               2、FBS培养基培养的mESC贴壁是否明显好于KSR培养基？为啥KSR培养基下几乎没有存活的细胞？
               3、MEF是否存在支原体污染的情况？
               4、我们复苏的mESC以前是用FBS培养的，是否是因为突然更换为KSR培养基，mESC不适应？
补充一下，我们用feeder+KSR培养基培养从广州生物研究所买来的miPS细胞时，也同样出现了细胞成团漂浮的情况，由于细胞来之不易，所以已经终止了iPS的培养。我们所采用的KSR培养基配方是广州生物医药与健康研究院提供的，KSR也是专门用于ES和iPS培养的。找的指定代理商买的，也不知道是不是KSR有问题。最近一直很迷惑，不知道下一步该如何是好。求高手指点，细胞养不好真的是耗时有耗力。

作者: 第七舰队 时间: 2011-8-4 21:41

你在传代的时候，用的多大浓度的胰酶？消化多长时间? ) b7 f& H) [4 c- \

作者: dilal 时间: 2011-8-5 10:29

回复第七舰队的帖子

0.25%胰酶，消化了2-3min

作者: christophe 时间: 2011-8-5 14:20

回复 dilal 的帖子# ~/ s; C/ F2 o9 j! T( O
; p" P, \- N) v& R
CGR8用feeder-free 养没问题的，无feeder条件CGR8的状态是比feeder条件下扁平块大一些，边缘也不如feeder上清晰，这都正常。
我们是用高糖DMEM+15%FBS+1%NEAA+1%GlutaMAX+0.1mMβ-ME+1%P/S+LIF.
既然无feeder没问题何必要用feeder，还干扰实验结果；7 N( ^/ C" ]4 i+ ]9 M5 P
既然FBS就很好，何必要用KSR呢。

作者: sapery279 时间: 2011-8-5 22:55

虽然没有养过CGR8这种mES，但是KSR培养基在支持细胞贴壁（无论有无feeder）和促进细胞生长方面是比不上FBS，如果楼主用的FBS质量比较好，不会导致细胞分化的话，用FBS养还是不错的，如果会导致分化，最好还是在用FBS复苏或是传代过细胞之后，换成KSR培养基。另外feeder-free的情况下，FBS和KSR都会使克隆平铺下来生长，感觉状态不是很好。

作者: luwei8157 时间: 2011-8-6 11:05

christophe 发表于 2011-8-5 14:20 & j/ G- {$ @8 {( \% d
回复 dilal 的帖子
' f: i2 W, I* I P% k% Y3 i* l$ d$ t) X$ x! E4 b
CGR8用feeder-free 养没问题的，无feeder条件CGR8的状态是比feeder条件下扁平块大一些， ...

* @' U( y" q5 J* [5 ?
同意。我们也是同样的方法，而且你买细胞的地方，也是用这样的方法：）

作者: dilal 时间: 2011-8-6 11:26

回复 christophe 的帖子+ Q) U8 P; V# b- n

谢谢你的建议，我们用的是Gibco南美的血清，没有经过ESC培养筛选，感觉细胞状态比较差，细胞集落周边有分支及分叉，不像我们以前养的细胞集落一样形态比较规则，圆圆的，鼓鼓的，镜下看起来集落很均匀。怀疑可能是血清的原因引起细胞分化，所以才改为用KSR（专用于ESC培养）。不知道你用的FBS具体是什么，能否透露一下？

作者: dilal 时间: 2011-8-6 11:30

回复 sapery279 的帖子5 i) i% R: q4 \. t, D& y

的确是，我们培养了一段时间也发现KSR培养的ESC贴壁性较FBS差一些。你说的先用FBS培养再改为KSR培养，确实是一个好方法，我们将尝试一下。

作者: dilal 时间: 2011-8-8 11:21

问题已经得以解决了。在此向大家汇报一下：" Z) f, @; c% C) a& I# J- Y
我尝试了一下用广州生物医药与健康研究院寄细胞时多余的培养基（KSR）来培养ESC，培养前我先加入了一定比例的1%NEAA+1%GlutaMAX+0.1mMβ-巯基丙醇（因为培养基放置超过了半个月），重新复苏了一瓶细胞，接种到无feeder明胶铺板的培养瓶中。复苏后第二天观察：大部分细胞都贴壁了，已有细胞集落形成，集落扁平，有些细胞周围有分枝。未出现前一批KSR培养基细胞成团漂浮的情况。
重新复苏了一管MEF（P1代）：复苏后细胞存活率不到10%，大量的细胞漂浮，细胞状态差。换液培养2天后发现：细胞生长缓慢，镜下细胞显得很薄，细胞核内可见黑色的颗粒状物质，细胞质中可见许多聚集的亮点状物质，遮光性强，细胞膜上粘附有圆状亮点。
重新配制KSR培养基，从而确定是否是血清替代物出现了问题。配制方法为：85%knockout DMEM+15%KSR+1%NEAA+1%GlutaMAX+0.1mMβ-巯基丙醇。用该培养基培养传代后的mESC，与广州的培养基进行平行对比。今天观察细胞发现：细胞贴壁可，漂浮细胞较少，未见成团漂浮的细胞。细胞状态留待进一步观察。
目前推断：1、原先的KSR培养基可能存在污染，但单独将培养基放到孵箱里未见有污染迹象，怀疑存在支原体污染。( p( ?7 [1 v4 i+ ^; U9 u% Z
2、原代提取的MEF可能存在支原体污染。依据：冻存细胞复苏效果差，复苏后的细胞显微镜观察结果像是MEF污染。
3、KSR培养基污染可能来源于MEF，血清替代物本身未见污染（还需继续观察）。
由于实验室尚没有支原体相关的检测手段，上述推断也没法证实。下一步准备重新提取MEF，扔掉所有冻存的MEF和可能存在的培养液。看来正规的实验室培养程序还是很重要，如果当初我们对原代提取的MEF进行了支原体等相关检测，就不会耽误这么长时间。
希望我们的教训能给大家一些帮助，如果大家有什么好的建议或者有价值的教训，以及自己实验室细胞培养过程比较完善的检测方法或者不足之处，可以借这个帖子共享一下。欢迎大家畅所欲言。

作者: christophe 时间: 2011-8-8 12:17

回复 dilal 的帖子" `1 s# ^8 J: G2 C9 k( y/ c5 c0 |
* a7 [# t" {4 [9 `3 M6 Y' I
我们用的是Millipore 的for ES 的FBS。
需要注意的是KSR在四度的保存期很短。( l1 u: r$ V, d! s) E/ X
另外，你KSR的污染来源怎么会是MEF呢？

作者: dilal 时间: 2011-8-8 14:22

回复 christophe 的帖子

怀疑是KSR培养基在MEF培养过程中发生了交叉感染，具体怎么污染的也不清楚，只是猜测而已，因为缺乏支原体检测手段。

作者: 573639471 时间: 2011-9-14 11:03

回复 dilal 的帖子

无feeder也行啊，feeder不是必需的啊？那干嘛很多人还用啊？人的ips不用feeder行吗

作者: dilal 时间: 2011-9-15 08:44

回复 573639471 的帖子/ v3 q$ d9 e$ h S
8 |( L" F9 w3 M
有些个别细胞系的ESC可以用无feeder培养，但是细胞相对于feeder培养容易分化，不适合长期培养。不过无饲养层培养将会是未来干细胞培养的趋势。

作者: yaner 时间: 2011-9-20 17:05

我觉得你的问题可能是细胞接种的太密，该传代时没传代，培养过度了

欢迎光临干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)