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标题: 支原体检测 [打印本页]
作者: goodboy    时间: 2011-8-7 15:56     标题: 支原体检测

老板让我把支原体检测技术建立起来。看了点文献有关于一次PCR和巢式PCR两种方法，不知道该选择哪种？望各位都说一下自己实验室的办法。不胜感激
作者: bllx58    时间: 2011-8-7 16:04

荧光素酶检测体系
作者: dilal    时间: 2011-8-7 17:39

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9 i, O* f3 ?6 {3 [) a3 S- _5 C
) j$ _; e: ?7 C- j* L5 S问一下你们实验室所采用的荧光素酶检测系统准确性和特异性如何？上次碰到一个销售干细胞血清的业务经理告诉我目前国内许多支原体检测试剂都质量不过关，假阳性和假阴性太多。目前特异性比较好的检测方法还是支原体培养和PCR检测。不知道你所采用的荧光素酶检测是哪里的？
作者: wwwert    时间: 2011-8-7 18:39

一般生物学实验室用简单的PCR就足够了
! T+ e( y( I% p  j/ F) d/ z我们就用一对引物的PCR$ G& {# W  J- l1 w6 P

6 }. R' Y' H3 H3 C6 v1 a* r" @' C作临床，做生物制品的，也许要用严格些的方法
作者: goodboy    时间: 2011-8-7 23:02

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% `0 Y6 q  s' \: Y, z
% {- [9 W' v( V; T能不能把引物序列发一下啊？还有我看到在PCR检测过程中最忌假阳性与假阴性的出现，贵实验室是怎么注意的呢？
作者: rain2402    时间: 2011-8-8 09:08

我个人觉得巢式PCR比一次PCR效果好。
作者: 牙牙丫丫123    时间: 2011-8-8 11:50

我们最近也在做支原体检测，可是总感觉结果不是很理想，假阳性或者假阴性太多，有没有稳定一点的结果
作者: 牙牙丫丫123    时间: 2011-8-8 11:51

回复 rain2402 的帖子+ w* n7 z9 J0 w- S5 j
! S' n5 Z& }+ t
巢氏PCR的结果稳定性怎么样？
作者: goodboy    时间: 2011-8-8 14:26

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8 B  _6 y: X, D9 ^1 O# ~' B4 b9 y0 w' ]1 h6 K
我看到有文章报道巢式PCR假阳性很高，可以分享一下你们的protocol吗？
作者: goodboy    时间: 2011-8-8 14:27

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6 e- I1 X2 d# M5 q$ v/ \9 i  ]/ ?- E+ i
能分享一下你们实验室的protocol吗？
作者: 牙牙丫丫123    时间: 2011-8-8 14:57

回复 goodboy 的帖子) k& T, |/ j  s' n. R& J  ]1 ^

* j% s7 D3 s) o  _$ H我们用的只是普通的PCR，可是每次结果都不稳定……. j5 ~! c1 T5 C6 @
作者: youtellme    时间: 2011-8-13 23:13

建立个人认为:
% j: T  h  C* i5 j1现在有专门检测支原体的试剂盒，做个出判断还是可以的。! s" @9 W: Z8 q' [; c0 X7 Q
2发现阳性了如果还想做的好点就PCR吧。方法自己选看目的了。* O5 `) R) Y# [3 N
3通过荧光检测。
1 L; W" D4 c" B0 `7 T4平时看看细胞生长状态有个大致的判断吧。
作者: wang3033    时间: 2011-8-14 10:18

1.一般采用PCR检测支原体即可，一般不会有假阴性，有可能会假阳性，
) K& |! Q) \) c) z! ?  y+ V" d2.电镜，将细胞培养基上清离心，收集沉淀，电镜看到支原体颗粒是最可靠地，沙斯爆发时，由于洪院士电镜下看到病人肺部细胞中存在支原体，导致非典病因是病毒或支原体争论！最后由国外学者电镜看到病毒，并测序鉴定到非典病毒
作者: wwwert    时间: 2011-8-17 10:13

goodboy 发表于 2011-8-8 14:27
- \! c% V, Z" w3 n2 j; U+ ]4 }4 H回复 wwwert 的帖子. a& I! y  O9 y' I

$ a2 u/ J. M4 ]0 [! g' f能分享一下你们实验室的protocol吗？

5 {6 q2 W+ f: L# Q2 ?( n我们用的这个引物+ v: Y) M) ?, y6 [8 |0 f
For: 5' GGG AGC AAA CAG GAT TAG ATA CCC T 3'
( m7 `! m+ a: T$ i3 HRev: 5' TGC ACC ATC TGT CAC TCT GTT AAC CTC 3'
2 Z! x1 n7 T0 C# E) \Product: 280 bp  n4 U. h  ^. d: S8 Y+ f; e
35个循环, & r9 n6 R) ^; ?+ q  Z! j- G
大约50ng模板,用kit提的,比较纯* F% J& N/ n7 L( r' E3 L
5 a  L6 v2 N; }3 T# x3 I! t
作者: kosmos.y    时间: 2011-8-17 11:04

支原体分子生物学检测方法有基因探针和聚合酶链反应（PCR）等方法。基因探针的核酸杂交法，虽然敏感性和特异性都很高，但基因探针常用同位素标记，放射性危害大，设备要求高且繁琐难以推广，近年来发展的PCR技术，使得支原体检测变得简便、快速、敏感、特异。
作者: goodboy    时间: 2011-8-17 14:56

回复 wwwert 的帖子5 w8 T5 |. T+ j- y
& ?( ?' W+ j* N1 @- p. w
你们提的是RNA 还是基因组DNA啊？不知道你们的引物扩增的是那个片段
作者: wwwert    时间: 2011-8-19 22:21

goodboy 发表于 2011-8-17 14:56 5 n. k4 R' U" R* @
回复 wwwert 的帖子: y# o. s( O3 _1 p- t

7 J1 |; X; ?+ f/ j& S. F你们提的是RNA 还是基因组DNA啊？不知道你们的引物扩增的是那个片段
0 @  I2 C/ e# ?
DNA! h+ Y+ J6 Y2 v) J7 ]. E' |. w* l
应该是扩增核糖体RNA基因的
作者: goodboy    时间: 2011-8-20 00:33

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