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标题: 原代MEF消化 [打印本页]
作者: nibirucome    时间: 2011-8-15 10:54     标题: 原代MEF消化

最近做了一次MEF的原代培养，剪碎的胚胎加入0.25%胰酶，37℃消化3min左右就变成了粘稠透明状液体，我消化了10分钟最后得到的MEF细胞很少，而且状态很差！看到有前辈说在消化过程中要吹打，而且要保留一定组织块这样细胞贴壁效果会好，为什么基本上没看到有组织块样存在呢？是不是消化过了？当时离心的时候看到管壁的细胞就比较少！
作者: X细胞    时间: 2011-8-15 11:07

请牛人说一下MEF原代培养的程序
作者: runsong    时间: 2011-8-15 11:54

本帖最后由 runsong 于 2011-8-15 11:57 编辑
# V: _) P6 g- V5 e
, z* s& d7 _7 P' _) e* I4 @/ p$ x这是很正常的，MEF原代培养简单的话就先仔细剪碎，至少剪300下，再加入大量胰酶（不要小气）37℃消化20min左右，成为粘稠透明状液体。用3倍于胰酶体积的培养液中和，直接接入培养皿里就行了。粘液里的细胞会自己迁出、贴壁的。待其贴壁后及时换液。, `$ ~" F; p& }0 s  X/ w
有两点需要注意：1、要充分剪碎，2、要用充足的胰酶。
1 Z+ c' k3 g1 D1 U有两点无需注意：1、不必消化为单细胞，2、培养液里的胰酶不太影响细胞生长。（如果不放心的话可以中和后离心，弃掉一些液体，不过不要弃掉粘液，上清也弃不多）0 l. s# Z& w2 q% }# y0 p
9 R. @. A2 x- l& Y- X
补充一点：我不是牛人，四楼坐板凳的才是。
作者: nibirucome    时间: 2011-8-15 12:56

回复 runsong 的帖子
7 d  s3 s- k, |5 s- j9 ]) L5 V0 U0 f: E5 l, `
无意做四楼的板凳！！
+ p5 z; R% n# f我想问个问题，您是说消化后的粘稠液体加培养基以后可以直接加到培养皿里面培养，无需离心？要是这样操作可以的话就比较方便了！
作者: llecstem    时间: 2011-8-15 14:20

我们是在含有collagenaseIV的培养基中剪碎，37°15分钟之后，再加入终浓度为0.005%的trypsin，37度温育 20分钟，到这的时候还是有一些组织块，然后用40um的的滤网过滤，加入3倍体积的MEF培养基离心，进行下步的培养
作者: 懵懂干细胞    时间: 2011-8-15 14:40

本帖最后由 懵懂干细胞 于 2011-8-15 14:42 编辑 6 ]0 s7 f6 ^* h1 d: U+ M: S

( A5 ], y0 h3 P+ r9 R 制备饲养层的方法.pdf (15.91 KB) 胚胎干细胞饲养层的制备.pdf (115.14 KB) 给你传两份protocol吧！
2 x( E) x+ G8 J( Y, e( h; n2 A. w上次采用的方法是用胶原酶消化了35min，一个小胚胎可以制成3大瓶！

附件: 制备饲养层的方法.pdf (2011-8-15 14:40, 15.91 KB) / 下载次数 42
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=MzE4ODV8ZGVjZTkwNmF8MTc5MzExNTM2N3ww

附件: 胚胎干细胞饲养层的制备.pdf (2011-8-15 14:41, 115.14 KB) / 下载次数 70
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=MzE4ODZ8YmQyNGZlYWR8MTc5MzExNTM2N3ww
作者: runsong    时间: 2011-8-15 18:16

回复 nibirucome 的帖子5 H$ {- K/ N9 o; V( G

( [2 D* U8 ]9 p& z& [" J. C是的，但这也是无奈之举。
1 e/ p. r" z0 J* m3 v: C, w+ {( Q胰酶并不适合做mef，很难消化为单细胞。选用其他的方法其他的酶效率会高几倍。
作者: runsong    时间: 2011-8-15 18:17

本帖最后由 runsong 于 2011-8-15 18:20 编辑
: e' y7 A7 I: f7 S& B. _1 b
. c4 |7 {3 A9 ~; I回复 nibirucome 的帖子# D/ W1 b0 b7 _$ j

4 m& r+ Y4 o8 F) f' K5楼的方法应该可以，4 [1 X& ?+ E8 [/ L' B2 Y6 M$ Y5 s
不过好像应该是0.05%的trypsin
作者: starlight    时间: 2011-8-16 07:11

消化过头了，建议降低胰酶浓度或者缩短消化时间，
作者: OBGYNob    时间: 2011-8-16 08:19

消化后的黏糊糊的一坨，如何使用贴壁的方法呢？因为一加入培养液那些组织就会浮起来了...
作者: dongxin    时间: 2011-8-16 08:56

我用过以下方法制备，效果很好！仅供参考
- ?1 M5 R5 ~+ f  C7 r! I原代MEF的制备
/ r3 e. `& o* a4 y, d3 ~* [5 Z( g（1）        将孕鼠断颈处死，取出子宫；
2 G4 z+ g4 i; F, }& ~  w$ ]) `（2）        将含有胚胎的子宫置于干净的100-mm培养皿中；" N; o  q4 z9 E$ h! u
（3）        将子宫用PBS清洗三次，去除血迹；
6 `/ O: ]) Q7 E# |8 J: h（4）       分离胚胎；( ?  B: [3 }8 n; G, x7 A& n
（5）        用镊子先去掉小鼠的头部，四肢，接着去掉肝部；
9 t1 g  t) ]; g0 H- u2 c（6）        清洗胚胎，去除血细胞；
( s# t$ ~% [' H（7）        用剪刀尽量将胚胎组织剪碎，约10分钟；
! w) h! a( m- U# D' [（8）        用 0.05%胰酶消化组织约3分钟，吹打5-10下；- S5 {! Z  R6 T. }
（9）        用 MEF培液终止并吹打组织块；
) R0 f( f! W& p% b) T' f( J（10）        用70um滤器过滤；
: C2 y/ A1 Y, \# c9 Q（11）        离心，铺于适当培养皿中，一般1个胚可培养一个35-mm培养皿。# q% M. E' t3 |& ~+ @7 v
作者: 123jiaoyue    时间: 2011-8-16 08:57

回复 runsong 的帖子; X; g, L1 m* y6 r# {5 o

5 {; q/ R& d' F0 o. z& ~0 z那你选用的其他的酶 是什么酶呢
作者: 123jiaoyue    时间: 2011-8-16 08:58

回复 OBGYNob 的帖子
+ g, `% y  a4 k+ T8 U
+ q) `4 S! N2 O! A% i  C貌似是这样的，加入3倍的培养基后，组织悬浮起来，细胞会慢慢沉降，然后贴壁
作者: sizhengliu    时间: 2011-8-16 09:59

我直接剪碎胚胎（剪成糊状就基本可以了），然后均匀铺在瓶壁上。一般第二天就有细胞爬出。
作者: nibirucome    时间: 2011-8-16 10:56

回复 sizhengliu 的帖子
+ _# D9 u+ O* D, k* n' t3 z. V6 n
直接剪碎？没有消化的过程吗？
作者: sizhengliu    时间: 2011-8-16 20:39

回复 nibirucome 的帖子
8 J' s$ [7 x: I" q2 g. K2 e! M0 K6 t& j* d: q) T
我没有试过用酶消化，不知道它们之间的比较情况，如果你做这个对照实验，可以告知下结果吗？
作者: OBGYNob    时间: 2011-8-17 09:22

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* z2 \7 p9 `5 |
: G" m  w* Q) M% h那得多久啊...文献上不是说换液的时候要把浮起来的组织吸掉吗？我都养了一个星期了，没有东西爬出来...天啊！！！
作者: zhlqlkpc    时间: 2011-8-17 14:45

16小时了，爬出的很少，24小时要换液，怎么办啊？
作者: zhlqlkpc    时间: 2011-8-17 14:46

16小时了，爬出的很少，24小时要换液，怎么办啊？
作者: zhlqlkpc    时间: 2011-8-17 14:46

16小时了，爬出的很少，24小时要换液，怎么办啊？
作者: zhlqlkpc    时间: 2011-8-17 14:49

16小时了，爬出的很少，24小时要换液，怎么办啊？
作者: 细胞海洋    时间: 2011-8-17 23:32

回复 zhlqlkpc 的帖子! S! A  @' G% V0 T
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作者: nibirucome    时间: 2011-8-19 10:33

回复 zhlqlkpc 的帖子* i( r' ?" e1 y4 T! N
2 B' E. y+ b3 L; ]3 E
你是怎么处理的？
作者: bllx58    时间: 2011-8-21 10:39

我觉得是你没有仔细剪碎
作者: smartyyu    时间: 2012-3-27 10:11

谢谢提供protocol的战友



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