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标题: 关于细胞消化的相关实验操作 [打印本页]

作者: 突击兵之小土豆 时间: 2011-8-17 16:05 标题: 关于细胞消化的相关实验操作

最近做实验，在细胞消化的过程中，发现自己对于其机理和反应的相关条件不是很清楚，上网查资料众说纷纭。主要是对于胰蛋白酶消化干细胞的过程，简单点说，就是用胰蛋白酶加入长满细胞的克氏瓶中（已提前吸取，弃掉培养液），来回摇动，使胰蛋白酶铺平培养面。是不是只要铺平了，细胞就在消化中，不用反复继续摇动？胰蛋白酶的消化能力有那么强吗？才0.25%啊。

除此之外，中和消化许多人采用血清或者是HANKS‘液，其后也需来回摇动，使其与培养面均有所接触。对于血清和胰蛋白酶的比例，网上也各有说法，麻烦各位战友能不能说说各个说法的原因。反正我们是用10%。
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最后，对培养面先用混合液（胰蛋白酶和血清）对培养面进行吹打，后用PBS或者HANKS’液进行多次吹打，我是新手，对于吹打有些顾虑和疑问？忘战友指教。个人认为用混合液时，由于细胞已经被作用消化过了，随便吹几下就行，然后用PBS或者HANKS'液进行仔细吹打，对于吹打的次数和力度，还有时间总是掌握不好，时间长了，怕细胞损失多，力度大了怕细胞机械损失大。用一句话解释啊，哥成了一个矛盾体啊，晕。忘广大战友赐教。

作者: 突击兵之小土豆 时间: 2011-8-17 16:10

还有一个题外问题，那就是有一次，细胞处理的有点多，发现消化时有一些白色团块，师傅说是消化过了，经过吹打以后，可以打散。1 {6 g+ ]* a0 i n! a

由此，想多嘴问一句，要是一直用胰蛋白酶消化，让细胞都消化成团块，吹打不就省力了吗，但是人家说消化成团块后，对细胞很不好。但是你想想，回头离心后，吹散，细胞不也是悬浮状态吗，也是分离的，感觉没啥区别。; a8 e5 t0 {8 _) L, K
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希望大家指正我的各种错误想法！

作者: rain2402 时间: 2011-8-17 16:22

胰酶消化的程度是一个关键：消化过度则对细胞的活性损伤较大，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失；消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。影响消化速度的因素较多，主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等。以笔者的经验，以轻吹或加培养液后轻摇可下较好，但对于经验不太充分的实验者而言是较难判断掌握的。

一般的细胞都是由梭型消化成椭圆型时终止消化，如果你消化的过了，你认为会怎么样？就像人一样，可以修指甲，但是如果你把皮剥了呢？

作者: baffle 时间: 2011-8-17 20:25

我刚开始也纠结于这些，现在根本不管那么多。。。多养养自然就好了

作者: pauldong 时间: 2011-8-18 08:13

消化时可在镜下观察，大部分细胞变圆漂浮起来即可终止，终止时用原培养基即可，培养基中的血清可以抑制胰蛋白酶活性。另外，细胞成团现象不是消化过了，而是消化不完全，就是一群细胞脱壁了，但是细胞之间还互相连接在一起，把细胞团挑出来在镜下观察一下就知道了。最后引用楼上一句话，多养养经验自然就丰富了。

作者: dongxin 时间: 2011-8-18 09:26

对于消化的问题真的是个经验的活，不同细胞消化后呈现的状态也不太相同。一定要一边消化（一般都会放置于37度、5%CO2的培养箱中若干分钟，依细胞的不同而不同），一边在镜下观察，如MEF一般胞质回缩、细胞间隙增大，即认为消化完全，终止消化；hESc则是在观察到克隆边缘透亮并卷起，即消化完成。* X- m8 T% e& E+ J6 I
此外，在消化完成后的吹打，一定要注意不要产生气泡，缓慢吸取，向外吹时要在枪头中留有少部分液体，这样可避免气泡的产生，也不影响镜下观察！
再次，胰酶的存放条件，别反复冻融，可以分装到小的离心管中冻存，用时置于4度，但合理安排实验，尽快用完！# R4 s- p( X7 x4 Y" H3 x% f5 M/ R
祝好运！

作者: clairezy1983 时间: 2011-8-18 16:23

回复 pauldong 的帖子 x+ e- p6 P* X( ]: N

对于MSC来说，消化到细胞变圆漂浮起来，已经消化过了，只要细胞之间的丝断掉就可以终止了，否则会有很多死细胞，胰酶的浓度可以自己调整的，我用的浓度是正常的1/5，我觉得变到1/10都可以的。

作者: 1301918986 时间: 2011-8-19 15:50

对于消化过程的控制我觉得还是有经验的成分。首先对于不同的细胞消化液和消化时间可能不同，一般情况下加入消化液后放置于培养箱内，当在镜下观察细胞胞质回缩变圆时就可以终止消化了。我们用0.25%胰酶消化是一般75cm2的培养瓶加3ml消化3min就可以了，然后用含10%的等量培养液终止消化。如果用含有DEDTA的胰酶消化则终止后应尽快离心，因为EDTA用血清终止不了。

作者: dragon513 时间: 2011-8-20 09:26

0.25%浓度是最常用的，浓度已经很大了。胰酶消化对细胞损伤挺大，建议显微镜下控制时间，刚开始变圆就开始中和。血清其实也用得不多，很多是加了点保险系数。我一般含10%FBS的培养基1：1中和。冲洗力度和次数均不可太多，挺伤细胞。这些只能多做多总结了，不是绝对的，各种细胞可能也有差异。

作者: yinjiqingqq 时间: 2011-8-20 16:22

回复突击兵之小土豆的帖子

其实对于消化细胞是个细心活，你提到网上说法的多样性，一方面是由于细胞类型的差异：有些干细胞，像MSC类的比较娇贵，细胞消化时间要短且胰酶的浓度要低些；像上皮样细胞，贴壁能力比较强，消化时间室温下要长些，但一般不会超过5min，0.25%胰酶浓度足矣，镜下观察细胞回缩变圆轻轻拍打瓶身，大部分细胞有飘起就可以中止消化了。这个要根据你样的细胞生长特性来决定。% C7 n5 N) d# g/ I. r- C
至于中和消化液，也是根据消化酶来选择的。我们一般使用胰酶就是用含10%血清培养液中止，也有些实验室使用其他的酶，就用Hank's 或是DPBS稀释。

作者: POPOLD 时间: 2011-8-21 21:33

利华

作者: 千里草 时间: 2011-8-22 18:51

消化间充质时，个人认为几步比较关键：1 一定用PBS液或生理盐水将取出培养液的平皿再洗一次，去除残留培养基成分，否则会降低胰酶消化效果。2 胰酶浓度，0.25%是最高的，可对半稀释后再用，消化时注意温度，胰酶最后提前在37度预热 3 消化时应在镜下观察，细胞间连接消失时即可弃去胰酶，加入培养基进行吹打。时间太短不容易吹打，太长就过了，影响细胞状态。总之，多实践几次就好了。

作者: echo 时间: 2011-8-24 12:10

个人的经验，胰酶消化时间长点，相对于不断吹打形成很多泡沫而引起的机械损伤，还是要小些的。

作者: huangcong1988 时间: 2011-9-19 16:50

消化时间要视细胞种类，胰酶量等等因素而定，如果细胞是那种贴壁比较紧的，那么消化时间要适当延长，如果细胞贴壁不好，那么消化时间就不要太长，因为胰酶消化时间太长对细胞有损伤，一般情况下消化时间为2~10min，胰酶用量也很关键，一般情况下500~1000微升就行，我养PK细胞，PK细胞比较经得起折腾，我就直接加1毫升，完了消化三分钟，之后再用力吹打，就能使细胞成为单个圆的细胞了，胰酶最好是分装到1.5ml离心管中，大约为0.5~1ml每管就行，用的时候拿一管，其余负20保存

作者: huangcong1988 时间: 2011-9-19 16:52

FBS的作用应该是能中和胰酶，使之停止消化，还有就是消化完吹打的轻重，个人觉得要视细胞种类而定，如果细胞比较好养，就使劲吹打没问题，如果细胞比较娇贵，那就轻轻吹打

作者: azzyou 时间: 2011-9-22 09:34

消化间充质一般采用现配的0.125%的胰酶，也就是稀释一倍，在显微镜下观察看到细胞连接消失即用10%的血清终止，吹打的时候新手可以找点吹打，老手就可以绕圈吹打，一般看到一层白色的膜状物质下来了以后就基本可以了。最后说一下，这个吹打的时候不要把管尖的培养液打掉，容易产生气泡。

作者: wangfang 时间: 2011-10-24 17:27

我们实验室用胰酶笑消化时不用摇动，只要加入胰酶后放入37度培养箱中放置30s-1min，拿出来中和就可以了。具体时间要看细胞的状态，状态较好的细胞消化时间较短，状态差的细胞消化时间较长，令外也与酶的公司、批次有关，想准确掌握还需要不断摸索！

作者: barley 时间: 2011-10-25 17:22

1，含血清的培养基一定要洗干净
2，配制或稀释胰酶无论用什么缓冲液都不能含钙镁离子
3，胰酶浓度根据细胞确定，用下限$ j" D5 Y! Y' t1 r2 s$ Y! i
4，胰酶加进去轻轻摇匀覆盖细胞就行，不能提前吹或者拍打，如果细胞成片下来就不能弄散了
5，刚开始做的时候可以在镜下观察，细胞变性后把瓶子立起来，不和胰酶继续接触，回台子终止* n& \* o$ h6 F7 h2 ], [9 e) z
6，可以把胰酶吸走，加入培养基吹打分瓶，如果没有信心的话，终止血清用0.25%胰酶的5%就可以，可以直接吹打，但是最好不要吹起很多泡# h* p3 R' M+ e+ S. M7 L9 \
7，在胰酶浓度够的前提下，如果消化不好可以在37度孵育，上限是半小时
8，胰酶要用进口的

作者: 举锅 时间: 2011-10-26 19:38

加胰酶消化时只需要其将细胞都铺到就差不多了，量不需要多，但是时间掌握很很重要，长了细胞受到伤害，时间短了消化不完全，若是强行吹打下去将会有很多片状物。我的经验是将瓶立起来若看到瓶上贴壁的细胞开始慢慢的往下掉了就差不多了。另外一旦消化好就应立即终止消化.

作者: dandan9230 时间: 2011-11-2 15:56

1消化时间，胰酶浓度都会因细胞种类而有区别。一般贴壁较强的，需37度，放2-3min需要镜下观察哦，看见胞质回缩，少量漂起。不要全部漂起的时候，就可以了。
2终止可加入10%FBS的全培养基。与胰酶量1：1，或略高于胰酶的量。轻轻吹打几下，不能有气泡，要轻柔。立即离心，弃上清。5 d9 V x1 q% a$ @' q
要多做，摸索一下就知道了。加油！

作者: 827914734 时间: 2011-11-9 12:53

就MSc而言，个人觉得完全可以消化到细胞变圆漂浮起来，MSC消化相对容易，即使0.125%的胰酶在室温下也能很快消化下来，如果大多数细胞已经悬浮，稍微吹打几下即可，个人感觉MSc贴壁没那么牢，而且这样消化下来接种效果也可。其实消化过程和吹打都会对细胞产生影响，如果吹打技术比较好的话（比如不会产生气泡），也可以尝试多吹打几次，这些都是完全凭个人经验，自己多操作几次，在看一下接种效果，就知道自己应该怎么做了。这种事情没必要每个人都统一起来。

作者: yangwy028 时间: 2011-11-9 15:06

消化时候，肉眼看胰酶浑浊后再吹几下，就不用看显微镜也知道细胞都已经变圆掉下来了，赶快终止就OK了。可以试试的。但是具体的细胞种类不一样，消化的时间差别也很大的。

作者: yangwy028 时间: 2011-11-9 15:07

不用含FBS 的，普通的培养基终止就可以了

作者: aulenuyah 时间: 2011-11-10 00:33

胰蛋白酶的消化能力很强，0.25%就已经是很浓的了。消化的时候只要胰酶铺满皿底就可以，不需要摇动。具体时间与每次买的酶活性有关，没有固定的时间。一般在显微镜下观察时，发现细胞便圆，轻轻振荡之后有少量细胞漂浮就可以终止消化了。终止消化时候的血清没有十分明确的浓度，可以用培养液，大约保证培养液和血清是1:1的浓度就可以了。混合之后用力吹打，可以尽情的用力，不过要控制尽量不要出气泡或者把液体吹出培养皿，直到把细胞完全吹打下来，一般这个时候的细胞贴壁能力和生长能力都比较好。不要等到看着大量的细胞都漂浮了再终止，那样的话胰酶对细胞的损伤太大，不利于细胞增殖。

作者: cmy008 时间: 2011-11-10 08:25

我是作间充质干细胞的，一般是用用0.25%胰酶常温下消化3-5分钟，看到细胞间隙增宽，细胞由梭形变圆就立刻用等量培养液终止消化，但没有继续作吹打，感觉消化下来的细胞偏少，但后期生长还可以。今天看了这个帖子收获不小，学习了。

作者: zhang0194 时间: 2011-11-10 15:01

这个终止消化的时间是很重要的，我们平时做的时候就把握下面这几点：0 [" s: L! j6 \. |" G
  前提是无血清培养基培养的；
      1. 消化时间是很短暂的，加入消化液，摇动10次左右就放在显微镜下观察，这需要助手，在瓶底还挂有细胞（形态没有完全变圆，还三三两两的在一起），立刻送入工作台，加1倍的新鲜培养液终止消化，一般这中时候再用移液管吹打3-4次就可以吸出来了，随后再用PBS 涮一下瓶子，别浪费吗。
      2. 胰酶的浓度，建议0.125%,浓度不高，这样消化不是很快，可以留下充足的观察消化状态的时间！

作者: yxwfly 时间: 2011-11-10 15:38

我们一般75cm2加入1ml 0.25%的胰酶。! M7 l/ |3 M A4 b$ ^6 x
加入胰酶后，缓慢地来回晃动，使胰酶铺满整个培养面；
置于显微镜先观察；
待绝大部分细胞变圆后，立即将胰酶吸出，弃去；* k+ W1 L8 l* I: d% q
加入含10%血清的培养基终止消化，进行后续操作。" \- c8 a0 o, ?7 C3 b/ `

要注意的一点是：要在细胞变圆但还未悬浮在胰酶中的时候吸掉胰酶，否则就连细胞一块吸掉了。1 X' f# H2 E9 A6 Y8 E W, G! @. x% l! `- l
这样做的目的是减少胰酶在传代细胞培养基中的含量，降低对细胞的伤害。

作者: dianying 时间: 2011-11-17 10:01

回复 yangwy028 的帖子

你好，
看见你打了招呼。谢！
但是看起来有点可笑，系统说我没权限回打招呼。所以就在这借块地儿招呼一下吧。但愿以后这网会大度一些吧。

作者: gaojingyu0311 时间: 2017-3-10 08:56

吹打的次数和时间对MSC的影响大吗？

作者: 细胞海洋 时间: 2017-3-10 21:32

回复 gaojingyu0311 的帖子* z7 B# S# V4 U: ?

建议你发新帖提问

作者: blackhei 时间: 2017-9-5 16:16

最近在养MSC，细胞状态不是很好，第二代的细胞已经老化，胰酶消化时比较困难，贴壁牢固，基本不变形，有极少部分漂浮，消化时间延长则已经漂浮的细胞严重受损，出现两次这样的情况。现在想到的是胰酶消化几分钟，如果消化不下来的话就只能吹打的时候多吹打几次，但吹打的时候动作要轻。

作者: 阳光正暖 时间: 2017-9-5 17:31

胰蛋白酶使用注意：
1、在使用胰酶细胞消化液的过程中要特别注意避免消化液被细菌污染。
2、胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长，会对细胞造成损伤，细胞铺板后生长状况会较差。
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贴壁细胞的消化：. Y" S" y( e5 N; [* M! D( r; |8 R0 r
1、吸去培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清
2、加入少量胰酶细胞消化液，略盖过细胞即可，根据胰酶效率差异可以增加惑减少胰酶用量。室温放置30秒至2分钟（不同的细胞消化时间有所不同）3 ]8 Q+ a6 F4 W. r% \# T
3、显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化呈白茫状；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来。
4、此时吸除胰酶细胞消化液。加入含血清的完全细胞培养液，吹打下细胞，即可直接用于后续实验如果发现消化不足，则加入胰酶细胞消化液重新消化。
如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。1000-2000g离心1分钟，沉淀细胞，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。% K, @0 U4 p$ f1 k; B
常用的细胞消化液为胰蛋白酶（Trypsin），EDTA等，其功能主要是使细胞间的蛋白质（如细胞外基质）水解，改变细胞间的连接，使组织或细胞片分散成单个细胞，制成细胞悬液用于进一步的实验。0 ~) d9 O, G# K7 [4 N* \( i
影响消化速度的因素较多，主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等。+ K7 ~, t) z9 o+ w% N
加入胰蛋白酶-EDTA溶液，视细胞瓶的大小加入体积为2ml或更多（依培养器皿的大小而定），以使充分浸润；/ E: x1 \" z2 v
一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶底由半透明（细胞单层连接成片）转为透明、点状（出现细小空隙）时，弃去细胞消化液，或看见培养瓶壁呈白茫状即可。并加入适量的完全培养液终止消化，吹打分散；如见大量细胞片状脱落，已消化过头，则不能顷倒消化液而直接进行下一步操作。（消化过头，可造成大量细胞从瓶壁上脱下，甚至造成细胞破碎。由于血清含有非特异性胰蛋白酶抑制剂，所以加入完全培养基可以终止反应。
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胰酶配置方法：
1、培养液配制，方便好用，对细胞影响小，并且培养液的ph值正好适合胰蛋白酶的溶解6 q. |: k" l* r2 r) T b+ b
2、生理盐水配制，要先调ph值7.2到7.4（①胰酶（1：250） 2.5 克②EDTA-Na 0.3克③NaCl 8.0克④KCl 0.4克⑤Glucose 1.0克⑥Phenol Red 0.005克⑦Water 1000 mL磁力搅拌2-3小时，调pH 7.8-8.0，过滤除菌。）, h5 g5 K4 s! h% A$ w
3、pbs（0.1%胰酶溶液的配制：称取胰酶粉末0.1g，先用少许灭菌过的PBS调成糊状，然后补足到100ml。置室温搅拌4小时或冰箱内过夜，过滤灭菌，分装，4℃保存备用。）; 或是hanks或是D-hanks液配制（1.称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，先用少许D-Hanks 平衡盐溶液（pH7.2 左右）调成糊状，然后再补足D-Hanks 平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温4 小时或冰箱过夜，并不断搅拌振荡；2.次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱保存备用，常用浓度为0.25% 或0.125%。胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可调用碳酸氢钠溶液调pH 至7.2 左右。）8 O) Y% h# u. w
一般0.45微米的一次性滤器过滤除菌，至于作用效果，需要消化一次细胞感觉一下，因为不同厂家的酶不一样，有的作用温和，有的作用剧烈。
4、是否需要四度放置过夜，取决于你的胰酶的纯度。过去的胰酶纯度不高，所以难以溶解，需要四度过夜. 而现在的胰酶纯度都很高，就没有必要四度过夜。从理论上来说，四度放置过夜，给细菌生长的机会，尽管过滤可以出去细菌，可是出不掉其代谢产物。5 @# z( b' N1 Q1 }- L5 P

胰蛋白酶不溶,有絮状物的原因，考虑有：4 S( T) j- z& L2 d* U# C4 H: N
1、过期或是酶已经部分变性# d7 ~) @7 [6 Z- K B
2、溶液ph值不对! k, h. a4 U+ F0 x! g0 l
3、在没过滤之前的絮状沉淀是正常现象，因胰酶多取自动物胰腺，沉淀为组织块，过滤后即可

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