干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: 人的原代培养 [打印本页]

作者: yangpan521 时间: 2011-8-22 11:54 标题: 人的原代培养

哪位高手做过人的原代培养，我的做法----采用组织块培养法，材料---药流畸形胎儿8月龄，9天是长出了细胞，但是一经消化细胞就变形了，初步判定可能出现低渗。培养液为10%ＦＢＳ，请指教

作者: evial 时间: 2011-8-22 14:32

是不是消化时间太长了？胰酶浓度呢？

作者: mhm289@live.cn 时间: 2011-8-22 14:41

光看标题，吓到！

作者: oucflora 时间: 2011-8-22 15:04

回复 yangpan521 的帖子- \: ~$ `0 w- F: u1 y4 X+ v
, k5 X/ }1 J+ S; V
发几张图看看

作者: yangpan521 时间: 2011-8-22 22:33

回复 evial 的帖子

图片没拍，胰酶是买sigma公司的成品，回来分装的，

作者: dongxin 时间: 2011-8-23 09:07

建议：首先试用胶原酶（作用会温柔些）；其次hESc喜团块状生长，你的是不是消化过了(成单细胞不可以)！祝好运！

作者: 单个核细胞 时间: 2011-8-23 09:24

看到标题，吓我一跳，楼主可否对这个“人的培养”做个介绍。

作者: evial 时间: 2011-8-23 09:29

一种是细胞就是变化了，变得畸形了。胰酶用0.25%的，无血清情况下3分钟以内，经常晃一下观察细胞洗下来没有，不要晃出来。看着都变球状浮起来了就可以加有血清的培养基中和阻断反应，然后马上离心去掉上清液。

作者: yangpan521 时间: 2011-8-24 09:11

回复 evial 的帖子! J, Y7 ^" U" W. p2 |( l9 Z- A. y) f

组织块长了9天才爬出细胞来，消化时外围的细胞都掉了，紧贴着组织块的细胞就没掉，如果消化时间长点，贴着组织块的细胞掉了，可是外围的细胞都已经变形了。

作者: rain2402 时间: 2011-8-24 09:27

讨论幼儿园教育吗？嘎嘎。。。。

作者: 一转身的距离 时间: 2011-8-24 09:45

标题好吓人！

作者: RIVA2011 时间: 2011-8-25 11:19

你培养的时候是用培养瓶还是培养板？用的是哪个厂家的，往往这种事情，也可能你是培养容器的问题~

作者: yangpan521 时间: 2011-8-25 13:37

回复 rain2402 的帖子. M; w7 y; P3 i! L8 n$ ^& B
4 o0 C7 t& r) L# o9 ~6 a
似乎你知道的挺多，请赐教

作者: haibara007007 时间: 2011-8-25 14:20

注意消化时间，这很重要，最高不要超过10min

作者: rain2402 时间: 2011-8-25 14:51

回复 yangpan521 的帖子
' K, J4 ?) }8 U0 |2 \
我的意思是培养人最初是在幼儿园啊。呵呵。不好意思。我也是初学者。知道的很有限。我没有要笑话你的意思。
看来你是做人的胚胎干细胞的培养。呵呵。
% b" r) \! B3 x5 K3 I! S
以小鼠的为例啊。请参考。$ |0 O3 Y5 [7 N9 h- |
组织块培养法：/ k5 i7 M9 ]- ]6 w
1) 用无菌眼科小剪刀或刮胡刀片将胚躯干剪(切)成1mm3以下的碎块,吸置于离心管内。
2) 室温下静置5～10min, 弃上层液，留下胚胎组织碎块。
3) 向装有胚组织碎块的离心管内加入1ml消化液,轻轻吹吸30sec。
4) 加入等体积的培养液终止消化。室温下静止5-10min。
5) 弃上清液,留下鼠胚组织块沉淀物。
6）加入 5ml培养液重新悬浮胚组织块,移入培养瓶内。每5个胚的组织块可使用1个100ml的培养瓶。
7) 补加适量的培养液,使组织块悬浮液能均匀分布于培养瓶表面。37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养。
8) 培养开始的前两天不要晃动培养瓶。第三天见组织块附着培养瓶表面, 周围生长出细胞。补充培养液或更换培养液,继续培养。每天观察。
9) 待细胞连成一片时,即可消化。消化时弃培养液,用PBS洗涤一次；加适量消化液（以能覆盖细胞层为度），在室温下作用大约30sec；弃消化液，让残余消化液继续作用。轻敲培养瓶底, 当细胞层出现裂隙时，加入培养液终止消化。或在倒置显微镜下观察，当细胞与细胞之间分开即可终止消化。8 h! P$ q4 g: E/ M1 m. w# Z
10）补加培养液，轻轻吹打均匀，吸置离心管内，静置5～10min。" |' J! A7 M5 X; A% y: m2 c
11）上层为单细胞悬液,下层为组织块沉淀。将上层单细胞悬液轻轻吸置另一离心管内,弃组织块。7 _( ]% @: U* S9 @5 h# Z5 Y
12）以800～1000rpm 5min离心，弃上清。加入培养液,重新悬浮细胞沉淀。以1:3比例传代。采用3～5代细胞作为饲养细胞。

作者: yangpan521 时间: 2011-8-25 15:31

回复 rain2402 的帖子5 t; }' }) Y( ]; e7 q

小鼠的原代很简单，12.5天胎儿胰酶消化法来做，还有其他大动物如猪、牛、羊胎儿采用组织块法培养都很成熟，没什么问题，唯独人不好做（本人认为）因为每一次取材都不同，也不知道组织在医院那里放了多久，而且性别也未知，所以做了几次都是在六天之后开始生长细胞，问题是-----不是每一皿都会长，如果有一皿有组织块长了细胞，接着这皿就会长的很多，而有的皿干脆一个也不长，不明白原因，都是一个人操作，怎么差异会这么大？请教

作者: rain2402 时间: 2011-8-25 15:43

本帖最后由 rain2402 于 2011-8-25 15:44 编辑 9 R1 T5 h, F3 a7 ?3 N, F

回复 yangpan521 的帖子
4 ^5 g8 y! m' |9 q' B+ z, M* }" @! F7 H
我觉得和胚胎的新鲜程度有关系。。。但是这个和胚胎的性别没关系的。。。我这方面没有什么经验。。我只会理论。呵呵。你接着呼叫高手。我也跟着学习学习

作者: songzxj 时间: 2011-8-26 09:48

用胶原酶IV，消化5小时左右，可以把组织块吹散，离心去上清，培养基重悬后种在皿了，其他操作同小鼠的原代细胞培养。理论上第二天就可以看到大量细胞贴壁，涨势也很快，否则有可能是药流的胎儿细胞已经死亡或者是不够新鲜。你的标题吸引了我，这绝对是全新的课题！！！

作者: 小麦兜 时间: 2011-8-27 13:12

应该消化液浓度太高了吧

作者: 小麦兜 时间: 2011-8-27 13:13

应该消化液浓度太高了吧

作者: dongxin 时间: 2011-8-31 09:20

回复 yangpan521 的帖子( r% I8 ]- k4 [/ `; L6 O r
7 U8 r4 j( r; E4 p
请教：你在提取细胞时，用的是从医院拿回来的整个胚胎吗，是否需要去除一些组织呀！

作者: yangpan521 时间: 2011-8-31 16:32

不是，是流产下来的胎儿，护士给剪了一只耳朵和胳膊上的一下块皮肤

作者: dongxin 时间: 2011-9-7 09:40

回复 yangpan521 的帖子

谢谢，还是会觉得有些怕！

作者: 雾里看花250 时间: 2011-9-18 11:43

伦理呀！！！道德呀！！！！！

作者: yangqiurui 时间: 2011-9-20 02:03

“人”的原代培养！？绝对没有人做过！& T# y% I1 A" B* f3 b3 \+ |
3 [ ?) t+ Q9 j1 r9 d& Y0 e( y
人胚胎组织细胞的培养还是有很多人做过的。你确定流产的标本绝对可靠、新鲜吗？你分离的是哪种组织呢？你确定那种组织适合用组织块贴壁培养法吗？你是用湿法贴壁还是干法贴壁呢？你同时对一标本做了2~3线培养吗？胰酶消化的细胞本来就会使细胞变形，不变成球形怎么脱壁呢？胰酶消化本来就会使组织块松动，要不然怎么叫消化呢？

作者: yangqiurui 时间: 2011-9-20 02:06

还有呢。。。。畸形胎儿你如何解释？是仅表观畸形无遗传学变异，还是基于遗传学异常的畸形？如果是后者，细胞培养确实比较困难，比如增值、存活不像一般细胞那么好养。

作者: azzyou 时间: 2011-9-20 10:18

脐带间充质干细胞消化之前是细长状的，如果消化过后是漂浮的小圆球状的话是正常的

作者: yaner 时间: 2011-9-20 10:30

胶原酶消化掉克隆，然后用移液管吹成小团传代试试看

作者: dandan9230 时间: 2011-10-27 10:37

细胞量要足了，再处理比较好。刚长出来，很脆弱。酶的浓度不能过高

欢迎光临干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)