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标题: western-blot的抗原封闭原理 [打印本页]

作者: 如来的观音 时间: 2011-8-28 23:02 标题: western-blot的抗原封闭原理

WB的抗原封闭原理是利用脱脂牛奶封闭了非特异性抗原表位，但是配置合适浓度的一抗可以选择BSA或牛奶，这不是在孵育一抗的同时也能起到封闭作用吗，何必要在孵育一抗之前利用脱脂牛奶封闭30分钟-1h？

作者: zzc2211 时间: 2011-8-28 23:49

个人观点：用牛奶或BSA溶解一抗，这么做没问题，我也这么做过。为什么先封闭，此处的关键有两点：1，抗原位点谁先占据；2，牛奶和非特异抗原，一抗和非特异抗原，这两对关系的特异性怎样，即结合力的强弱哪种大，二者是竞争关系。如果先封闭，上述这两点就不用考虑了。

作者: osterix 时间: 2011-8-29 08:46

我们一直用封闭液来稀释一抗的，但是还是要在一抗孵育前进行半个小时的封闭液处理。这样能更好的降低背景。如同二楼所说，同时封闭和一抗孵育会造成谁占抗原先的问题。还是先孵育半个小时好。愚见！！

作者: FireDragon 时间: 2011-8-29 10:23

是动态过程，抗原结合位点的范德华作用最强，非特异结合位点的亲和力应该是相同或相近的，所以牛奶可以竞争性的结合非特异位点

作者: langziforever 时间: 2011-8-29 14:19

我个人认为在一抗前的封闭并不是为了封闭什么非特异性抗原表位，而是为了封闭膜上未结合上蛋白的空白位置，这样可以减少在杂交时，一抗血清中抗体与膜的非特异性结合，降低背景！一般如果要封闭一抗血清中的非特异性抗体的话，我们会在杂交前的一抗中加入制备该抗体时所用空宿主菌的细菌破碎液！

作者: lyricys 时间: 2011-8-29 16:16

我也觉得是竞争性的，实验室还有人只封闭15分钟的，但是背景仍然算干净。

作者: hany2007 时间: 2011-8-29 16:31

无论是nc膜还是pvdf膜，都与蛋白具有非常强的亲和性，同样与与免疫球蛋白性质的抗体可非特异性结合。转膜完毕后，膜上除了我们的上样蛋白泳道会被上样蛋白结合，其余都是空白。所以必须用非特异性蛋白结合封闭。这样在杂交一抗时，一抗就只与目的蛋白结合，而后再与二抗孵育时，二抗也就主要与一抗结合。如果把封闭膜这杂交一抗两个步骤合并为一步，更多的可能是两种：1.曝光时全膜显色，黑乎乎一张黑板；2.目的条带无法检出，因为稀释一抗通常最低为1:1000，可以想一想，仅仅特异性的与目的蛋白条带结合的信号强度大，还是分散在全膜上的信号强度大！其实可以雪地追踪来打比方，干燥的土地上足迹难辨，若是雪地上，无论是人的足迹还是禽兽的蹄爪印迹，皆是一目了然。
封闭一般最好用脱脂奶粉，脱脂奶粉内的非特应性成分丰富，封闭效率高；但稀释一抗最好用BSA，BSA成分单一，可最大可能的避免抗体与稀释液成分非特异结合，从而可提高一抗的相对有效工作浓度，达到两个效果：1.增强信号强度。2.节省一抗。有时用BSA
1:3000稀释后曝光的信号强度比用脱脂奶粉1:1000的还强。二抗稀释还是用脱脂奶粉，目的还是为了减少非特异性结合，尽量减少背景杂带。" y' b Y3 X- r
呵呵，我就知道这么点，全都晒出来了，不妥之处，尚望拍砖。

作者: xbcrown 时间: 2011-9-8 09:13

学习了。。

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