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标题: 铺板时如何才能把细胞铺均匀？？ [打印本页]

作者: 仁心仁术 时间: 2011-9-2 12:06 标题: 铺板时如何才能把细胞铺均匀？？

[img][/img]小弟在用肝癌细胞铺12、24孔板时，总是铺不均匀。先把细胞悬液种板、再加培养基、经十字摇匀4-5遍、显微镜下观察细胞已散均匀、放入培养箱时再十字摇匀1-2次，可是第2天发现还是没铺匀，中央一大坨（照片右上角），周边散在分布。求教各位老师，有何良策赐教？？& S5 V, a K8 C5 `6 {0 V. P

作者: dilal 时间: 2011-9-2 13:00

建议楼主先加培养基，再接种细胞。摇晃时不要产生涡旋，这样细胞会集中到中间，另外放到孵箱中时最好放在中间比较平的地方。如果不行可以铺明胶试试。

作者: angelyannan 时间: 2011-9-2 13:00

估计是因为十字形摇匀使得细胞聚集在中央，你可以只左右摇匀或者前后摇匀试试，还有就是细胞接种前一定要混匀了，将培养板转到培养箱的过程中尽量保持平衡，不要倾斜。一点建议，你可以试试。

作者: yangpan521 时间: 2011-9-2 13:01

我与你有同感，我是在6cm皿内混不匀293T细胞，细胞混不匀的话包毒效果就很差，折腾了快一个月了，还是没什么进展，期间导师亲自做给我看，可是一经我手就是混不匀，我也是十字摇，求高手指点

作者: tangyvhuang 时间: 2011-9-2 13:16

中间一大坨的话，肯定是摇晃的时候产生漩涡了，我一般是先加好培养液，把培养液先摇晃，使整个皿底都是浸润到液体，再加入细胞悬液，前后晃五次，左右晃五次。然后放到培养箱里面。$ S* e5 @$ }0 Y/ R- d8 {3 Z! `
如果细胞都集中到一个方向密集的话可以考虑一下是不是培养箱不平，看看隔板是不是平的，看看中间是不是沉了

作者: wang3033 时间: 2011-9-2 13:26

十字摇匀没错，不过要贴桌面摇，不能在空中十字摇匀

作者: dahui 时间: 2011-9-2 13:58

培养箱不平，或者培养箱里的托架不平，但是24孔板是平的，楼主说的是中间一大坨，而如果是因为设备的不平的话，不会出现中间一大坨呀，只能是边上有月牙形的细胞堆积。
铺板计数，大家多推荐的十字摇匀，也是公认的，但是您首先得保证细胞悬液是均匀的，我怀疑是楼主过分依赖也强调十字摇匀了，以至于到了自己手里，就拼命的让24孔板在自己手上做“十字运动”了，所以它的反面效果就出来了，中间一大坨，您可以参考楼上的胞友说的，左右5次、上下5次。
祝您好运。

作者: future007 时间: 2011-9-2 19:55

给你个绝招，我铺96孔板都没问题的方法，在50ml离心管中把细胞混匀，用一毫升枪边在培养孔边缘转动边加液体，争取墙头在孔边绕两圈把液体加完，要匀速加，不用晃，直接培养就行，保你没问题。

作者: zzc2211 时间: 2011-9-2 20:25

6孔板混匀比较简单，12、24、48孔板混匀不容易，溶液少，dish周围因表面张力液体较多，细胞也会多。楼主都集中在中央，就是摇匀时涡漩到中央了。我的做法和8楼的一样，建议楼主试一试。

作者: zzc2211 时间: 2011-9-2 20:27

6孔板混匀比较简单，12、24、48孔板混匀不容易，溶液少，dish周围因表面张力液体较多，细胞也会多。楼主都集中在中央，就是摇匀时涡漩到中央了。我的做法和8楼的一样，建议楼主试一试。

作者: llecstem 时间: 2011-9-9 09:27

我遇到了和楼主一样的问题，学习了

作者: xuyq706 时间: 2011-9-9 09:47

首先应该确定是否是培养箱不平的原因。但楼主是中间细胞较多，应该不是培养箱的问题。我的感觉也是6孔板混匀比较简单，12、24、96孔板混匀不容易，十字摇晃时还应该注意力度，过猛和过轻都会让细胞产生向心力，聚在中间。

作者: 令扬展 时间: 2011-9-10 09:52

十字摇匀没有问题。楼主可以试试在桌面上摇匀，另外摇的时候摇保证液体是前后、左右晃动，没有产生涡流。摇匀后运送的过程一定不能倾斜，不然液体恢复的时候一样有涡流会使细胞集中中间某处。

作者: 小木梅 时间: 2011-9-13 22:09

有一个问题是，如果种的细胞密度较大的时候，摇晃反倒使细胞间相互黏在一起了，可以试试从板中心向外画圆圈匀速滴加，尽量一样，不用摇晃，显微镜想观察没有问题就直接培养，如果出现不均匀，就用枪头重新吹打

作者: pla269 时间: 2011-9-14 01:41

十字晃动一定要慢一点，如果还不好就再巧四角，这对小板效果好

作者: wangyashuai 时间: 2012-2-10 10:35

我培养细胞好几个月了，24孔板也种了不知道多少次了，有时候中间一团，有时候边缘密集，有时候中间和边缘密，就是没几次匀的。我现在种不同密度细胞，先往孔里加入PBS润湿，在接种细胞悬液前吸去PBS，细胞是和培养基混合之后，靠着侧壁缓缓加入，在全部加完后，进行十字摇匀，前后八下，左右八下，左右摇时是悬空的。可最后的结果是按加入的顺序，，也是细胞密度从大到小的顺序，出现中间密，中间和边缘密，边缘密的情况，就是没有比较匀的。有问题的只有在吸弃PBS时将板倾斜了一下，难道是倾斜又放下后产生涡流使细胞向中间聚集？请大家帮忙分析一下。

作者: 荷荷 时间: 2012-2-10 16:10

建议先加适量培养液，再加细胞悬液，之后轻轻的慢慢的贴紧操作台面左右、前后摇动，注意动作一定要轻、慢，否则容易形成涡旋，让细胞聚集在中间，之后可以在显微镜下稍微观察一下。另外最好放在培养箱的中间部分。

作者: 细胞海洋 时间: 2012-2-11 12:33

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作者: wangyashuai 时间: 2012-2-11 13:53

回复荷荷的帖子

我今天试了一下，先加入0.9ml培养基，再加入0.1ml细胞悬液，加完在镜下看就是中间多，越摇越多。之后我又把细胞和培养基混匀后，沿边缘转着圈加入孔中，看起来比以前好多了，就看明天细胞贴壁后结果如何了。

作者: ying 时间: 2012-2-27 19:19

居然没人说到经典的8字晃匀法！端着dish或者板，想象超净台上面有个“8”形（横着）的轨道（大小和速度取决于你的孔的大小）画8字画8次左右，最后在十字晃两下，无论一开始你的细胞是怎么加进去的，最后一般都是匀的：）

作者: lingchen04 时间: 2012-2-27 20:18

十字揺匀可行，但左右和前后摇匀之间要停一下，等培养基静止一下，否则会容易形成旋涡

作者: holywater 时间: 2012-2-28 10:36

本帖最后由 holywater 于 2012-2-28 10:38 编辑 + O( V8 L- P3 ^7 y9 U6 v

我这么说吧，你那十字不是标准十字，是做了些轻微的圆周运动，结果中间有了漩涡。然后就是那样子了

解决方法有一个简单的一个难的。难的是保持良好的十字，或者干脆前后左右翻转板来代替你手划十字
                              简单的是细胞悬液先和新鲜培养基混匀再去种版，那么这种问题很好解决
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                           另外，根据我的经验，6孔板是最好的，可以十字混，大于这个就非常容易中心旁边不一了，而小于这个没法用手晃混匀嘛# q- `( R2 i! U1 V. k* X, _

               最好还是先混再种版，问题全解决了

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求威望

作者: zdgrp 时间: 2012-2-28 13:39

回复 future007 的帖子4 A. B: A6 |. P; }

弱弱的问，贴壁加还是直接加到培养液里？

作者: huoyan2006 时间: 2012-2-28 17:24

铺板均匀的前提是铺前细胞悬液是均匀的，不然后面怎么摇都不会均匀的。4 {% X! P3 L# J: A1 [
楼主可以用大一点的安瓿瓶，将细胞在里面反复吹打混匀，一边铺板一边混匀，动作要迅速，板铺好后贴着桌面十字摇匀就可以了。

作者: receiver1 时间: 2012-2-28 17:35

12、24或48孔板，由于体积小，液体移动空间有限，用十字摇法不容易摇匀。你可以在把细胞加上后，用蓝枪头把整个的细胞和培养基吸上来再吹下去，反正里面培养基也不多。只要不快速吹打，不会对细胞造成伤害，就能混匀。

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