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标题: 有人养小鼠骨髓间充质干细胞并传过很多代的吗？ [打印本页]

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作者: dragon513    时间: 2011-9-14 10:39     标题: 有人养小鼠骨髓间充质干细胞并传过很多代的吗？

         我以前养过其它组织来源的，骨髓来源间充质干细胞总是传两代就不大长了。当时觉得很奇怪，后来无意交流中又认识了曾在香港大学和清华专做小鼠BMSC研究的朋友。我跟他们讲这事，他们说他们也遇到同样的问题了。偶尔（机率很小）能多传些代数但不知道什么原因，感觉有点运气成分。. }$ Q' g2 Q" D% N0 n- g; G
    我原本以为是自己操作不好，结果很多人都遇到过这种问题，而且是知名实验室。现在还是能查到一些文献报道用小鼠BMSC能传好些代，但细读其方法并无明显不同，基本上大同小异。8 [1 _! E3 P1 Q  l) n
    我真是搞不明白，有其它实验室做过这方面的工作有类似经历或能够较长期传代的吗？如愿意能否分享下方法或体会吗？

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作者: dragon513    时间: 2011-9-14 10:41

另外细胞经检测没有污染或其它异常情况，细胞一直不长。没法长满传代。

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作者: 踏雪寻梅    时间: 2011-9-14 23:21

不会吧，我传到第7代了，小鼠的。

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作者: wangweilie0418    时间: 2011-9-15 08:31

我这做人间充质干细胞的，也到5代了，长势很好啊，而且我这长期培养骨髓间充质干细胞，没有发生过类似的情况，您不妨再养一批试试。

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作者: 麻团    时间: 2011-9-15 10:48

关注，我养的也是同样情况

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作者: dragon513    时间: 2011-9-15 14:35

回复 wangweilie0418 的帖子: e$ V  u$ }1 h' ~1 T! W! D
9 ?- s% j2 L1 ~$ S! U* k9 T+ T3 i
关于BMSC似乎种属间有很大差异性，我做过猪BMSC，问题不大。小鼠BMSC能传3代左右慢慢就不长了。

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作者: dragon513    时间: 2011-9-15 14:53

回复 踏雪寻梅 的帖子# C, r: i0 u) K

3 a" r8 }& ^- `% `无论如何，你们在某个方面克服了某个细节问题。我重复过很多次的，不管你信不信，我原以为这仅是个偶然因素，结果与港大和清华研究生谈及此事时才注意到我们居然遇到过同样的问题。其它人的方法我不清楚，我可以将我们的方法晒一下。    选取6~7周龄健康小鼠，雌雄各半。颈椎脱臼处死后立即用75%酒精浸泡2 min，迅速采集小鼠前后腿，取股骨。采集样品时注意尽量避免血液或其它组织的污染，采集的组织样用4℃预冷的Hanks盐平衡溶液（HBSS）反复清洗。去除股骨和胫骨上的肌肉和筋膜后用4℃预冷的HBSS反复清洗。剪去骨两端关节暴露髓腔，用无血清DMEM培养基冲洗髓腔，将收集的冲洗培养基通过40 μm细胞筛网得单细胞悬液，1 500 rpm离心5 min。去上清后用完全培养基悬浮并接种于35 mm培养皿，37℃培养箱中静置15 min使更易贴壁的巨噬细胞、上皮细胞等贴壁，吸取未贴壁细胞悬液再次接种于T25培养瓶，于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。24 h后首次换液去除未贴壁细胞，此后每3天换液一次。% u: R: R, T9 R% h
    另外，我们DMEM培养基、抗生素、血清均用的是GIBCO的。第1次按1：2传代，以后按1：3传代。我估计其它实验室方法与这大同小异，我想知道这个方法为何能分离猪BMSC但分离小鼠BMSC时开始都长得很快，传了两代就长得很慢了。请有经验的高手分析下原因。谢谢！

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作者: dragon513    时间: 2011-9-15 14:56

回复 麻团 的帖子
$ O( [+ x! ~5 `  i& h) p  H2 E+ M  ?$ D( A  i
？是与我们还是踏雪寻梅遇到的情况类似？

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作者: dragon513    时间: 2011-9-15 15:08

回复 踏雪寻梅 的帖子
7 H9 s! F3 _/ ^6 w! Q$ _) B
: ]7 A, v+ q* Q5 q# v- N4 x既然你们能做好必有过人之处，我对你们实验室的方法关注以下问题：7 Y" e0 \5 Z6 I" w! l! |+ }
1.小鼠年龄。有些是用新生小鼠，我们是做的成年小鼠（6-7周）。2 |8 _, m  v# Z% ?- w
2.基础培养基。DMEM-HG，DMEM-LG，DMEM/F12，或其它？我们用过DMEM-HG、DMEM/F12，似乎没有明显区别
8 z, i( e; t+ S- W3.胎牛血清。我们用的是GIBCO澳洲FBS和GIBCO FBS（MSC qualified），这两种都用过，后者效果更好。2 b4 {% M  H; r' R. t: Y& v, j
4.曾用过Percol密度梯度离心，感觉收集的细胞比较少。从形态上看密度梯度离心后也没感觉更纯，所以就直接采用差速贴壁法了。不知道这是不是我们主要原因。
! c8 |! o: i! ^( k' z. x& k4 ^( r/ F5. 离心转速和首次换液时间，我们采用1000 rpm，5 min。24h首次换液。

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作者: xiaoyurly    时间: 2011-9-22 16:52

培养小鼠MSC最好选用周龄较小的，这样细胞活力才高些。
- u) L1 g! v8 m  K6 p& f2 _+ o+ h我们实验室用4-5周龄小鼠，全骨髓贴壁培养，20% FBS αMEM培养基，一般都能培养到7-8代。
2 E/ x" ?% ]4 J另，MSC好像不适宜用DMEM-HG培养

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作者: andreqin    时间: 2011-9-27 16:03

应该是血清问题，国内分装的南美血清感觉很不稳定。我们实验室以前也遇到过此种情形，不是一种细胞长的不好，是所有细胞都不好。怀疑是血清里面血红蛋白含量过高

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作者: dragon513    时间: 2011-9-28 17:37

回复 xiaoyurly 的帖子5 p. [% \% R: b' L
+ G% c% r5 _4 \. t6 w: @2 o
“MSC好像不适宜用DMEM-HG培养”这个有依据吗？我们养的其它MSC都用DMEM，其它来源MSC似乎没啥问题

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作者: xiaoyurly    时间: 2011-9-29 09:39

回复 dragon513 的帖子
/ t8 V% R* e( x. p0 y4 w
+ ]9 F$ ]3 J; j: y: B2 e一般培养MSC用DMEM-LG，也就是低糖DMEM，可以防止干细胞分化。平常用于培养各种细胞系的是DMEM-HG，即高糖DMEM，可以促进细胞贴壁，两种培养基的glucose含量是不一样的，前者是1.1g/L，后者是4.5g/L。

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作者: 金戈    时间: 2011-10-4 00:07

dragon513 发表于 2011-9-28 17:37
. ?+ g+ n# M9 M0 X( w回复 xiaoyurly 的帖子; N) r. \  m; c. D

4 i/ X" g3 f* n$ ]+ c$ ?  N  H“MSC好像不适宜用DMEM-HG培养”这个有依据吗？我们养的其它MSC都用DMEM，其它来源 ...

7 F# Q9 ]# [% j7 ]8 i2 o' P一般是用低糖培养，高糖不是不可以，因为基础成分基本一样，就是葡萄糖的含量差别。但是高糖的情况下细胞容易分化。

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作者: jj.jianjia    时间: 2011-10-4 05:36

我做BMSC的时候也碰到了这样的问题。有的时候细胞状态好，就长得快，有的时候状态不好或者传的太稀，就会变得扁平肥大，出现了传说中的senescence。可能和medium有关。后来补加了glutamine， non-essential amino acid，好了一些。楼主可以试试。

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作者: dragon513    时间: 2011-10-8 09:24

回复 jj.jianjia 的帖子; \' x( S! q0 T6 B( H5 {
! w3 Z/ c8 |+ h- `9 Q  c9 p
好的，谢谢！

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作者: dragon513    时间: 2011-10-8 09:25

回复 金戈 的帖子% T# c# c2 Q! |) c  K1 b
, \" e8 O; d$ C" z2 Q
谢谢，下次改成DMEM-LG试试

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作者: dragon513    时间: 2011-10-8 09:26

回复 jj.jianjia 的帖子! U: k% O$ s  l, }2 k/ m
# X8 `+ f( l' P' T8 M$ Q
谢谢！

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作者: meister    时间: 2011-10-9 09:44

是完全培养基的问题，　血清或者基础培养基需要调整

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作者: sasa    时间: 2011-10-10 08:02

我们用DMEM-HG  + sigma 顶级胎牛血清

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作者: 麻团    时间: 2011-10-10 12:18

回复 dragon513 的帖子
& O) X* @. L! @7 `" b1 i: _* m7 N$ a8 [; T! U0 p$ `
与你们的情况类似

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作者: illidancui    时间: 2011-11-6 22:56

之前一直做大鼠的长的还行，八九代还能用。现在刚开始做小鼠的，刚传了一次，觉得还可以，后边看看情况如何。如果有类似问题再和楼主请教。

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作者: 李1二    时间: 2011-11-8 20:14

楼主  请问现在情况怎么样了  我的方法和你是一样的  原代细胞数量状态都挺不错的  但是一传代就不行了

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作者: 卡门    时间: 2011-11-15 21:49

我之前用的GIBCODMEM的低糖，培养的不是很好，现在用DMEM/F12+15%的FBS（GIBCO）挺好的

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作者: zsc78    时间: 2011-11-15 23:37

我用了多种培养基试过，很难传过4代。当然添加细胞因子除外。

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作者: bathpp2007    时间: 2011-11-18 16:19

我用的是DF12 10%gibcle 很慢地长 有问题 但不知道是在哪里 郁闷ing

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作者: bathpp2007    时间: 2011-11-18 16:20

我用的是DF12 10%gibcle 很慢地长 有问题 但不知道是在哪里 郁闷ing

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作者: asejon    时间: 2012-2-8 10:58

不知现在楼主的细胞如何了？我也是用全骨髓法培养的，有几点疑惑同大家探讨探讨：1、4℃预冷的溶液必要性大吗？感觉十几度的室温对细胞并无影响；2、细胞筛网我建议不用，因为我尝试的几次用筛网对干细胞损耗非常大。3、“完全培养基悬浮并接种后，静置15 min使更易贴壁的巨噬细胞、上皮细胞等贴壁，吸取未贴壁细胞悬液再次接种”，请问这个步骤有文献支持吗？我也遇到了巨噬细胞混杂的干扰，谢谢！4、另请问做过小鼠BMSCs梯度离心分离的朋友，请问选用的细胞分离液的密度选用的是1.077还是1.073的还是1.082的呢？

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作者: 细胞海洋    时间: 2012-2-9 01:43

回复 asejon 的帖子
' K1 _: o- c4 G7 E! r! w1 z3 N: h; H( D) a
这个讨论很好 建议你重新发个贴子
5 J8 m. K) _# O# \( v
) n2 p4 z2 Z, h. D# b# b9 M$ L' Q- N回复贴不太能吸引大家的注意力

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作者: jyf200383    时间: 2012-2-20 21:12

楼主现在养的怎么样了？还在养么。我目前也在养小鼠的MSC 方法类似，我也比较奇怪前期步骤中的 静置15min的那个步骤，能否说明一下，谢谢

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作者: violet_sc    时间: 2012-7-11 21:09

回复 asejon 的帖子
, T* I- E! t& K! [7 g9 @3 i. q) y* H# h7 @) Q! v# w) w
同样的疑惑，尤其是第四个问题，请问这些问题你有答案了吗？求解！

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作者: violet_sc    时间: 2012-7-11 21:11

回复 asejon 的帖子+ E; Q0 b* H0 o0 \

/ T) T; u: j0 X4 @& Y0 F3 I- Y, m1 q5 D5 o我在准备分离培养小鼠的BMSCs, 第一次做，希望能多学习些

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作者: live861215    时间: 2012-10-24 14:38

回复 illidancui 的帖子7 \; P2 L6 \4 q) E+ z, ~& x6 P9 ]! e' x
3 |: D" Y! e! x' s/ f
我现在做的是SD大鼠，刚开始做，我是用的是percoll液进行分离的，第一次没分离出来，第二次我配了1.090,1.077,1.067,1.055的梯度percoll分离，效果也不好，我每次用一只两周龄的SD雄性大鼠，能分享下你的经验吗？你采用的是什么分离方法。
# n2 ?4 s, J6 a" ?" k% _) ~先说下我的方法吧：
+ d& f1 |% [# B/ e/ ]% A首先准备两个培养皿，分别加入无血清低糖DMEM12ml与6ml；然后大鼠脱臼处死，放入75%的酒精中5分钟，取出后，取大鼠前后股骨放入第一个培养皿中，并去除肌肉，转入第二个培养皿中，再用5ml的注射器吸取培养基冲洗骨髓，再收集第二个培养皿的细胞悬液于离心管中，1000 rpm离心15分钟，去上清，加入1ml无血清培养基重悬细胞，再在另一离心管中分别加入梯度percoll液（由离心管底部至上分别是高浓度到底浓度的percoll 2ml），最后将1ml的细胞悬液加在percoll上，3000rpm离心25min，出现一层乳白色的薄层，用1ml的移液器吸取这层细胞，将其加入到一新的细胞培养盘里，加入10ml含10%FBS的低糖DMEM中，于37°，5%的二氧化碳培养箱中培养。
+ {; h7 {3 K6 E6 d) \$ `希望指教！

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作者: 细胞海洋    时间: 2012-10-25 08:35

建议你发新帖提问, F% N0 S7 S' @; O

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作者: wujh1986    时间: 2012-10-25 08:46

我们养的小鼠的BMSC一般都到五代了啊，小鼠要选择周龄小的，四周就可以了，可用密度梯度离心啊，αMEM+10%FBS。MSC不能用高糖培养基，易分化

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作者: sysuhoo    时间: 2012-10-25 08:56

就我们实验室养小鼠MSC的经验来看，小鼠的确实最难养，比人和大鼠的都难，但是也不是完全那么难。相对于人和大鼠来说，血清和培养基对小鼠MSC的增殖都不是最关键的，我们实验室比较过进口的和国产的血清，差异并不是十分大，而且现在一般都用国产血清来养，最多能养到20多代，而且在10代做分子表面标记都正常。其实我觉得对小鼠MSC而言，最关键的是细胞密度与细胞消化的控制，特别是在4代以前，一定要注意，要有耐心，不能贪进度和多。只要能过了4代，后面基本上就没有任何问题，一般像细胞系一样，一传3正常传代即可。

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作者: chengge21    时间: 2012-10-31 10:43

回复 dragon513 的帖子) |" e6 b; ^& u# E
5 q" d; _& Z" Z2 `
我觉得用DMEM培养基冲出骨髓后在过滤之前是不是应该用1ml针头吹打一下，毕竟很多细胞是成团块存在的，直接过滤的话会损失一部分细胞，个人建议。我做的是SD大鼠的骨髓间充质干细胞，效果不好，传代效果也不好。   还有我觉得巨噬细胞15分钟贴壁并不明显，骨髓里面的血细胞倒是应该注意去除。

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作者: cuizhuzhu    时间: 2012-11-1 14:50

我现在才刚开始养！总觉得细胞的状态不好!可能是血清的问题！杂细胞很多！

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作者: dragon513    时间: 2013-1-29 12:23

回复 jj.jianjia 的帖子
6 N, V7 `5 T8 D0 s% n; l; R
8 G  |+ r5 `3 H7 P9 v2 N好的，谢谢分享！

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作者: dragon513    时间: 2013-1-29 12:24

回复 illidancui 的帖子
! n% J) r! \4 M8 C6 J* H
3 Y$ P& R" }9 _* b5 l  j2 q现在怎么样了？顺利吗？如果顺利能不能晒下方法呀？谢谢！

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作者: dragon513    时间: 2013-1-29 12:30

回复 asejon 的帖子% U% Z* a4 X- V9 `/ S) m6 |

8 `+ y7 d# i: o* Q15分钟去除巨噬细胞、上皮细胞等是在一本教科书上看到肌肉源间充干细胞这样可以的，上面讲这些细胞会贴得很快，MSCs要慢一些。我也想着基本原理都一样就借用过来了，没有验证过，但应该不会是分离成败的关键问题。书好象就叫组织工程学吧，记得不太清楚了，我以前以前也做肌肉源MSC。

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作者: dragon513    时间: 2013-1-29 12:31

回复 jyf200383 的帖子: O7 l/ D0 o3 r7 s; ?# [- k
9 d/ r' d9 F5 P
15分钟去除巨噬细胞、上皮细胞等是在一本教科书上看到肌肉源间充干细胞这样可以的，上面讲这些细胞会贴得很快，MSCs要慢一些。我也想着基本原理都一样就借用过来了，没有验证过，但应该不会是分离成败的关键问题。书好象就叫组织工程学吧，记得不太清楚了，我以前以前也做肌肉源MSC。

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作者: dragon513    时间: 2013-1-29 12:34

回复 李1二 的帖子' Q* V7 D- {/ c( `$ M, p# [

' T& F3 d) g5 ~# N8 e. E# N" W" }1 a呵呵，我还是没做出来，情况跟你的一样，一传代就完了。郁闷了好久，后来换成大鼠，方法基本差不，就没什么问题了。

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作者: dragon513    时间: 2013-1-29 12:36

回复 violet_sc 的帖子8 n1 i9 [  c' e! y, j

9 N& @0 t+ _/ p& X( g. r- D, M+ f: X第4个问题：我看到资料percoll或ficoll分离液分的也是单核细胞并不能真正意义上提高细胞纯度，无论梯度离心还是差速贴壁都可以，这应该不是实验成败的关键。

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作者: dragon513    时间: 2013-1-29 12:43

非常感谢大家关注！我当时实验很苦闷，没想到一石激起千层浪，而且还真能找到不少同样情况的兄弟姐妹们。某知名干细胞公司也遇到过类似情况，只是他们分出来了，他们说原代长得太慢，一直等到它长满，传两代就不用那么小心了。尽管我换成其它种属了，只要我还做干细胞相关研究，我就会继续关注的，太多的偶然就是必然。很抱歉有一阵没有上干细胞之家了，也没有及时回复。希望我提供的信息对大家有用，大家也多晒晒方法，有心人可以做做分析和比较，要是有人能专门做点工作那是最好了。

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作者: 老姜    时间: 2013-2-1 01:53

小鼠骨髓间充质细胞的培养一则与鼠龄有关，更重要的是要用小鼠骨髓间充质细胞培养专用培养液，细胞立即长的好，别的间充质都能养出来，不是技术问题。我们最初与楼上的同僚得到一样的结果，现在养小鼠骨髓间充质细胞一点没问题。

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作者: 沁蓝之城    时间: 2013-2-5 15:16

我用的是70um的滤网，文献上也是这么说的啊& j* M6 T8 ~9 I* [! A& M

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作者: franklinhg    时间: 2013-2-5 15:28

种属体积越大，MSC越好养。 小鼠的MSC主要是要小鼠年龄比较重要。C57和Balb/C的分离出来都不一样。

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作者: azzyou    时间: 2013-2-5 16:39

回复 sysuhoo 的帖子
1 ]! U5 q* g( `6 }% Q3 S8 Y, O0 R6 _  E% a
同意你的观点，原代主要是混杂了很多杂细胞，MSC长得比较慢，等到传代到4，5代左右，杂细胞基本去除，就能像正常细胞系一样传了。

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作者: dragon513    时间: 2013-3-20 11:26

回复 老姜 的帖子  ^/ _  U! ~: m0 x" ~
0 c+ R9 V/ K0 [, [3 s
谢谢！请问老姜：你们所用的“小鼠骨髓间充质细胞培养专用培养液”是什么培养液？哪个公司生产的哪类培养液（低粮、高糖或DMEM/F121:1），加了些什么？能做些详细的说明吗？不胜感激！

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作者: dragon513    时间: 2013-3-20 11:27

回复 franklinhg 的帖子
0 A* w6 N0 U5 w
9 r: V" ?3 N$ Y) z' P) y动物体积越大越好养，是真的么？这个说法是怎么来的？

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作者: dragon513    时间: 2013-3-20 11:28

回复 azzyou 的帖子) d; A* \# _+ Z, C, L8 n

  e3 M% x# X1 d) n( P也许是吧，谢谢大家的关注！

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作者: CatchField    时间: 2013-3-20 13:10

我们目前传到第十代了 没继续往下传过，看细胞状态还不错。

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作者: 老姜    时间: 2013-3-20 21:29

回复 dragon513 的帖子
6 X3 Q  f$ t/ o' E! T& E: M: K; l, v& K/ Q7 {$ J* Y
STEMCELL Technologies公司. E-mail:info@stemcell.com
6 E+ x, T* o- ^# t( ?  I- VMesenCultO products for mouse mesenchymal stem cell research include:) ]0 t3 X: c+ J+ q
      产品名称                                                                         容量             产品号. t2 \# ]6 L- Y$ m5 X$ y$ Q
MesenCult MSC Basal Medium(Mouse)                                    400mL       cat:05501
6 O: W/ C; {8 J+ Qmesenchymal stem cell Stimulatory Supplements(Mouse)      100mL       cat:05502: u  \- D+ Y1 M3 R
MesenCultO Proliferation Kit(Mouse),containg cat#05501 and #05502    500mL     cat:05511. i+ J7 u6 A$ k+ Q! y7 n
注：红色O是O里有个R。

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作者: ljj0558    时间: 2013-3-26 08:36

回复 dragon513 的帖子
# V2 b& k) D2 k% F& ]1 c: o
4 N$ x* e; d9 t& y; G关注，我养的也是同样情况，我可以很确定的养到第二代，但是第二代传代几乎消化不下来，消化下的部分细胞贴壁后生长及其缓慢

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作者: shagu    时间: 2013-4-7 19:36

回复 dragon513 的帖子
- @5 a8 J: r4 m  {# E9 |0 X! g: e
我养大鼠MSC，传到第2代就不太长了，勉强传第3代后似乎还衰老了，请问楼主的细胞有改善吗？经过哪些方法改善细胞生长状态的？非常谢谢，实在养不下去了！

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作者: dragon513    时间: 2013-11-11 10:45

回复 shagu 的帖子
/ m2 h8 Z( r$ `* w( [
$ a6 Z- S. K$ [. x9 y. X7 C+ d大鼠的BMSC好象没什么特别之处，很好养呀。很不好意思才很久没来了，现在才回复，可能问题已经解决了哈。谢谢关注！

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作者: dragon513    时间: 2013-11-11 10:47

回复 ljj0558 的帖子
" U7 l: u' O& T& \
2 G8 L2 P% Z; l. g) g我就说嘛，这确实不是一个人才出现的情况。但愿那些做得顺利的人能够无私地奉献下他们的经验和细节。

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作者: dragon513    时间: 2013-11-11 10:49

回复 CatchField 的帖子
+ a# L  w) j5 }; W+ ?+ f1 R. E& k6 Y2 o% h. w0 Y0 @: Z+ j
能分享下您的操作细节尤其是培养条件吗？

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作者: zhen022    时间: 2013-12-23 21:41

卤煮做了那么就，现在结果怎么样了，经验如何，给分享一下，长的细胞都是啥样给晒晒看看

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