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标题: MSC 冻存问题 [打印本页]

作者: andylee824 时间: 2011-9-15 14:13 标题: MSC 冻存问题

近来，MSC复苏后显微镜下活率能达到70%，可是贴壁率很低，是什么原因呢？冻存液用的是10%的dmso和90%的FBS;冻存时，细胞融合度大约在90%到99%之间，是不是融合度太高了，细胞老化的量已经多了。请高手指教，谢谢

作者: tjutiger 时间: 2011-9-15 15:04

复苏的存活率70%有些低，拿贴壁的就更少了。可能与你冻存的步骤，与复苏的步骤有关，基本原则是慢冻快苏。

作者: hwlightning 时间: 2011-9-15 18:58

10%的DMSO、40%胎牛血清、50%培养基（我是用的低糖DMEM）. h( @: \6 M0 m$ c. L5 C
4摄氏度放40分钟、零下20度放30分钟、再放零下80度、放24H就可以放液氮罐保存了
一般就放-80度保存, q" f R! J/ y5 d# |6 ^
如果有程序降温盒就省事了，直接零下80! i3 W6 R: v# q5 T! \
复苏效果很好1 Q( r2 h6 A" {
冻存的细胞融合度80%左右吧！+ I: j/ w/ I/ H2 M9 i- U, k
如果冻存细胞多要先把冻存液配好放四度冰箱，因为DMSO放热，刚加进去和容易损伤细胞，常温DMSO对细胞毒性也大。
复苏细胞我用的42度水浴，速度要快，不能有冰晶。
取细胞加入准备好的20ml培养基中，离心。重悬，培养
希望能对你有帮助

作者: hwlightning 时间: 2011-9-15 18:59

用完全培养基就是1:3:6

作者: menghy 时间: 2011-9-15 22:00

本帖最后由 menghy 于 2011-9-15 22:01 编辑
3 m% R/ m/ c* G; ^
楼主应将更详细的复苏步骤写出来更好分析一些。3楼的回复其实已经很详细了，我个人认为用10％的DMSO＋20－30％FBS＋培养基就可以达到很好的冻存效果，在复苏后效率也能达到85－90％了。为什么要用90％的FBS呢？还有就是在冻存的时候选取的细胞根据你培养的周期在对数生长期是最好的，细胞密度太大，就会发生接触性抑制，细胞停止了增殖，这个时候冻存的细胞复苏后效率就会降低。

作者: andylee824 时间: 2011-9-16 08:51

好的，谢谢各位楼主。你们提供的方法我都做个试验看看

作者: andylee824 时间: 2011-9-16 08:53

回复 hwlightning 的帖子

你说得复苏时，不能有冰晶，意思是在水浴锅中，细胞要完全快速融化吗？

作者: hwlightning 时间: 2011-9-16 09:52

回复 andylee824 的帖子- A# x7 S* b7 i+ P4 J N+ z

要慢冻速溶

作者: andylee824 时间: 2011-9-16 11:56

在水浴锅中,快速的晃动，是等全部融化了拿出来，还是有少量冰晶拿出来？
楼主的意思就是等冻存管中全部变成液体了，再拿出，是吧？

作者: wangyimei 时间: 2011-9-20 10:29

本帖最后由细胞海洋于 2011-9-20 11:25 编辑 % G& I8 E3 U3 J8 {# @3 |% J1 }

按照文献上说的都是细胞在复苏的时候，不需要等到培养液全部都融化，而是大部分细胞融化，有一些小冰晶的时候就可以了，然后吸出细胞到离心管的培养液中，然后离心，种到培养瓶中就可以了；第二天再换新鲜的培养液，以去除冻存液中残存的DMSO；
还有间充质干细胞在冻存的时候不用走4°，-20°的温度梯度，直接将冻存管中的细胞就棉花包好，直接放入-80°冰箱过夜，第二天放液氮中就可以了，复苏效率很高，至于冻存液中各种成分的比例可以用FBS:DMSO=9:1;也可以培养液：FBS:DMSO=5:4:1来冻存。

作者: dwl1209 时间: 2011-11-22 16:42

回复 hwlightning 的帖子

请教，程序降温盒的原理是什么？为什么可以直接放-80℃呢？你的复苏效率有80%以上吗？非常感谢！

作者: deshenglll 时间: 2011-11-23 15:55

冻存液要加培养液的。还有就是你的细胞冻存密度也要注意。复苏后细胞的活率在70%比较低了。复苏培养后这70%里面估计还要损失个10%左右。

作者: deshenglll 时间: 2011-11-23 15:55

复苏时间要少于2min。

作者: 飞翔的十字架 时间: 2011-11-24 07:13

回复 dwl1209 的帖子: C/ ?/ W; O/ S" q6 L, H
" m' l' [# R, D; Z8 d% ?
程序降温盒中加入异丙醇，在-80℃冰箱中达到-1℃/min 的降温效果，即慢冻的效果。

作者: tkpss18 时间: 2011-12-29 10:20

之前有前辈跟我说过，细胞冻存血清的浓度不能太高，会对细胞往后的形态有影响。他建议血清冻存的浓度为20%或以下。我们现在冻存细胞的配方是10%DMSO+15%血清+65%DMEM。/ l0 u! I( O3 j, E ~
冻存的话还是建议用程序降温盒，效果会比较好。8 G7 G% G. i/ L( ^" ~
复苏的话也想跟大家请教一下，我看过有人说不离心，直接加完培进去培养。第二天半换液去掉DMSO. 复苏的时候用离心还是不离心好？还有清洗DMSO用点滴法会不会好一点？谢谢。

作者: yuwenlan 时间: 2011-12-29 10:51

冻存液FBS

MSO=9:1完全没问题。最大可能是操作有问题。9 r& r! t& L0 e; S$ I1 G
娥的操作：1.冻存液，新鲜配制后0.22um过滤后4度储，不超过1周使用。2.冻存细胞时候冻存液（4度）重悬细胞后分装到冻存管，放进冻存盒（4度），直接放进-80度冰箱，过夜，转液氮。3.复苏细胞要尽快将细胞从气态液氮或-80度环境置于37度水浴摇晃，待还仅剩一小小块冰晶时候取出。4.细胞可直接接种，或者去除一下下DMSO（10倍体积预热培养基稀释后离心）再接种。
注意：从水浴里取出的细胞用培养基稀释步骤要缓和，细胞有个适应DMSO浓度变化的过程。5 k |1 V' h" r# O; ^8 g# k
Good luck.

作者: tkpss18 时间: 2011-12-30 11:08

回复 yuwenlan 的帖子5 N% J/ m" O- x

我想请问一下大家在复苏的时候，如果是用离心的方法去DMSO的话，在离心完后有没有出现像Jelly like substance的东西，这个有人说是因为复苏的时候DNA会从死掉的细胞释放出来，然后会把附近的细胞团在一块。其实这个情况也不是每一次也会发生，但是一旦发生了就会有很多细胞流失。是不是唯一的解决方法就是加DNAse?

作者: tkpss18 时间: 2011-12-30 11:12

回复 deshenglll 的帖子, o: ^; Y4 n& j, W
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我想复苏的时间主要是根据样本复苏的体积和容器来确定。最主要是不要把样本完全解冻。

作者: 湖南干细胞 时间: 2012-11-5 16:17

回复 hwlightning 的帖子/ U$ ?- z* W: w( ?3 W0 T0 W* o

细胞复苏时，我们都是37℃水浴，42℃会不会太高了

作者: hwlightning 时间: 2012-11-5 17:23

回复湖南干细胞的帖子/ \9 B, {! L# ?+ O; ~! B* t
1 r9 K* v" D. u4 b: K! [
我复苏细胞一直用的是42℃，复苏的细胞情况都非常好。

作者: 湖南干细胞 时间: 2012-11-5 19:56

回复 hwlightning 的帖子

谢谢。

作者: 漂流萍 时间: 2012-11-15 14:43

回复 tkpss18 的帖子

请问，为什么复苏的时候样本不能完全解冻呢？

作者: na6021023 时间: 2012-11-15 22:38

回复 hwlightning 的帖子. }' H0 a6 V5 ?% u: Y1 f

原来大家都是42度水浴。我们实验室一直用37度水浴，而且怕污染还给冻存管外套一个PE手套的指头。每次都眼看着2分钟过去了，还是有冰晶。学习了。

作者: deshenglll 时间: 2012-11-16 16:18

70%比较低了，再加上不贴壁的细胞，那就更少了。看看是不是操作的问题。我们一般39度水浴复苏两分钟，用4度生理盐水洗去DMSO，洗两次。
冻存前细胞不要长的太过。90-95%都还行吧。冻存密度：106-2*107/管。祝你好运。

作者: lazyworm 时间: 2012-11-21 11:27

5%DMSO就行了，用配制好的培养基配制冻存液，只用FBS还是有点浪费哈。复苏时水浴锅温度40度比37度要好。

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